張維瑞　劉盛榮　周修趙　阮俊峰　陳緯緯　崔曉偉

摘 ?要：考察不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基條件下pH對(duì)香菇、滑菇、金針菇漆酶活性的影響，為香菇、滑菇、金針菇的栽培提供重要參考。固化培養(yǎng)基以及液體培養(yǎng)基以NaOH作為堿化劑，固體培養(yǎng)基以殼灰作為堿化劑，考察不同pH對(duì)3種食用菌漆酶活性的影響。結(jié)果表明：微堿化培養(yǎng)可提高3種不同食用菌的漆酶活力，并與培養(yǎng)基的物理狀態(tài)有關(guān)。香菇在固化、液體、固體培養(yǎng)基中，pH分別為6.5、6.5以及6.0時(shí)漆酶活性最高，比對(duì)照提高5.3%～14.0%;金針菇適宜的pH分別為7.0、6.0和6.5，與對(duì)照相比提高35.9%～343.0%;滑菇適宜的pH均為6.0，與對(duì)照相比提高3.1%～94.9%。

關(guān)鍵詞：pH;漆酶;香菇;滑菇;金針菇

中圖分類號(hào)：S646 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Effects of pH on Laccase Activity of Lentinula edodes， Pholiota nameko， and Flammulina velutipes Grown in Different State Media

ZHANG Weirui1，2， LIU Shengrong1，2， ZHOU Xiuzhao3， RUAN Junfeng1，2， CHEN Weiwei1， CUI Xiaowei1

1. School of Life Science， Ningde Normal University， Ningde， Fujian 352100， China; 2. Fujian Higher Education Research Center for Local Biological Resources， Ningde， Fujian 352100， China; 3. Edible Fungus Management Stations， Pingnan， Ningde， Fujian 352100， China

Abstract： Laccase is a key enzyme involved in the degradation and utilization of lignin and has a relationship with mushroom cultivation cycle and product quality. In this work， NaOH was used as the alkalization agent for both solidified media and liquid media， and shell ash was used for solid media， the effect of pH on the activity of laccase of Lentinula edodes， Pholiota nameko， and Flammulina velutipes grown in different state media was investigated for providing a basis for their cultivation. Results showed that the micro-alkalization of all tested culture media could improve the activity of laccase of the species， and its effect was related to media type. The optimal pH values of solidified， liquid， and solid media for L. edodes laccase activity was 6.5， 6.5 and 6.0， respectively， with a 5.3%?14.0% increase of laccase activity in relative to their controls， and for that for F. velutipes was 7.0， 6.0， and 6.5， and the increase in the activity under optimal pH values was 35.9%?343.0% compared with their controls. As to P. nameko， pH 6.0 was optimal for all three media for maximizing laccase activity， 3.1%?94.9% higher than those of their controls.

Keywords： pH value; laccase; Lentinula edodes; Pholiota nameko; Flammulina velutipes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.012

漆酶是最早由日本科學(xué)家Yoshida[1]從漆樹中分離得到一種可催化酚類反應(yīng)的一種酶類，隨后Bertrand[2]將其命名為漆酶（lactase）。漆酶是一種以銅離子為活性中心的多酚氧化酶，屬藍(lán)色多銅氧化酶家族[3]，能夠催化酚類物質(zhì)或者多酚類物質(zhì)，生成對(duì)應(yīng)的醌類化合物等[4]。漆酶廣泛分布于多種植物、真菌、細(xì)菌以及少數(shù)昆蟲中，在白腐真菌中的分布最為廣泛，其研究一直受到人們的重視。

漆酶與木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶等是參與木質(zhì)素降解的重要酶類[5]。近年來，漆酶在造紙工業(yè)、飲料加工、環(huán)境保護(hù)等方面得到廣泛研究及應(yīng)用[6]。

食用菌栽培方面，漆酶在食用菌生長發(fā)育過程中起重要作用，參與培養(yǎng)料中木質(zhì)素的降解，此外調(diào)控原基分化、影響子實(shí)體形態(tài)及發(fā)育[7]。孫淑靜等[8]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的菌株其菌絲生長速度較快;任鵬飛等[9]研究香菇不同生長階段漆酶活性與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)漆酶活性與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。此外，漆酶分解木質(zhì)素的同時(shí)還產(chǎn)生酚類或醌類化合物等有毒物質(zhì)，是一種很好的殺菌劑，可抑制雜菌的生長，從而防止雜菌進(jìn)一步污染[10]。嚴(yán)培蘭等[11]發(fā)現(xiàn)漆酶活性高的黑木耳菌株，栽培產(chǎn)量高，其抗霉能力也高。因此，提高食用菌培養(yǎng)過程的漆酶活性，對(duì)預(yù)防食用菌雜菌污染、提高食用菌產(chǎn)量具有重要意義。

食用菌漆酶屬一種誘導(dǎo)酶，受多種不同因素影響，與木質(zhì)素及其衍生物相關(guān)的芳香族或酚類化合物、碳源或氮源種類濃度及其比例有關(guān)，此外金屬離子及濃度、溫度、pH對(duì)漆酶活性也有較大影響[12-13]，另外漆酶活性與不同菌株也有關(guān)。但迄今為止，研究主要集中于培養(yǎng)基、離子種類及濃度、材料孔徑大小、溫度等對(duì)漆酶活性的影響[5， 14-16]，但pH對(duì)漆酶活性的影響研究極少，尤其是固化培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基不同物理狀態(tài)下的對(duì)比研究未見報(bào)道。本研究以香菇、滑菇、金針菇3種我國常規(guī)栽培菌類[17-19]為研究對(duì)象，對(duì)培養(yǎng)料進(jìn)行微堿化處理，分析和比較3種食用菌在3種不同物理狀態(tài)下的漆酶活性，為食用菌微堿化培養(yǎng)料處理提供依據(jù)，從而為降低栽培污染、提高栽培產(chǎn)量奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌種 ?香菇L26、滑菇5188和金針菇F8801，均從福建省三明真菌研究所引進(jìn)。

1.1.2 ?栽培料及培養(yǎng)基 ?木屑、麩皮、石膏等購于福建省古田縣食用菌輔料市場，殼灰購于福建省寧德市蕉城區(qū)殼灰經(jīng)營部。

固化培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白陳3 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、 VB1 0.1 g，加水至1000 mL。

固體培養(yǎng)基：香菇、滑菇的固體培養(yǎng)基均為木屑（79%、78%、76.5%、75%）及殼灰（0、1%、2.5%、4.0%），以及20%麩皮和1%石膏，含水量為55%，滅菌后pH為5.5、6.0、6.5、7.0。金針菇固體培養(yǎng)基為棉籽殼（71%、70%、69%、67.5%）及殼灰（0、1%、2%、3.5%），23%麩皮、5%玉米粉和1%石膏，含水量為63%，滅菌后pH為5.5、6.0、6.5、7.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?培養(yǎng)基制作 ?固化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其滅菌后在凝固前用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH分別至6.0、6.5、7.0，CK（5.5，對(duì)照）為自然pH，制作平板，冷卻、接種，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)。

液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基滅菌后用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH分別至6.0、6.5、7.0，CK（5.5，對(duì)照）為自然pH;裝入250 mL的三角瓶，裝量100 mL，冷卻后接種，置搖床150 r/min 25 ℃培養(yǎng)。

固體培養(yǎng)基：將闊葉樹木屑、棉籽殼、麥皮粉碎，過20目篩，稱料，將木屑、棉籽殼、麥皮、石膏干混攪拌均勻，殼灰溶于水后倒入料中，攪拌均勻;裝入規(guī)格25 mm200 mm試管，每支裝入40 g培養(yǎng)料，裝料高度及松緊度盡可能一致，高壓滅菌，121 ℃，滅菌150 min，滅菌后冷卻，接種，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)。

以上實(shí)驗(yàn)每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.2.2 ?固體培養(yǎng)基酸堿度測定 ?滅菌前、滅菌后，以及不同培養(yǎng)時(shí)間取培養(yǎng)料2 g，加入5 mL的去離子水，充分混合，靜置10 min用pH計(jì)測量酸堿度。

1.2.3 ?粗酶液提取 ?固化培養(yǎng)基：培養(yǎng)10 d后，用打孔器在培養(yǎng)基菌絲生長外圍取3 g培養(yǎng)基，加入30 mL去離子水，用SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打碎（功率400 W、時(shí)間15 s），25 ℃浸提4 h，發(fā)酵液紗布過濾，離心機(jī)4000 r/min離心10 min，吸取上清液，即為粗酶液。

液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)10 d，發(fā)酵液紗布過濾，其他操作同上。

固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)15 d，距試管頂端菌絲1 cm處取菌絲及培養(yǎng)基混合體3 g，打碎，加入30 mL去離子水，25 ℃浸提4 h，紗布過濾，其他同上。

1.2.4 ?漆酶活性測定 ?漆酶活性測定采用ABTS法，參照劉蘋等[19]的方法。移取1 mL粗酶液置2支試管中，其中一支試管通過沸水浴滅活，作為對(duì)照。反應(yīng)體系為1 mL粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L的ABTS緩沖液，反應(yīng)3 min，分光光度計(jì)在410 nm波長處測OD值。定義每分鐘使OD均值增加0.1所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U），用以下公式計(jì)算漆酶活力[20]。

式中：A為3 min吸光度;t為反應(yīng)時(shí)間的變化量;V1為反應(yīng)總體積（mL）;V2為測定酶活力時(shí)所取的酶液體積（mL）;為3.6104 mol/ （Lcm）;N為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 ?數(shù)據(jù)分析方法 ?數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件處理，統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析，差異顯著后進(jìn)行LSD多重比較。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同培養(yǎng)基狀態(tài)下pH對(duì)香菇漆酶活性的影響

表1可知，3種不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基下，pH對(duì)香菇漆酶活性均有較大影響。除液體培養(yǎng)基pH 6.0與pH 7.0、固體培養(yǎng)基pH 6.5與pH 7.0差異不顯著外，其余不同pH間差異均達(dá)顯著水平。固化培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基pH 6.5時(shí)，香菇漆酶活性顯著高于其他不同pH，其中固化培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基pH 6.5時(shí)漆酶活性分別比pH 5.5、pH 6.0和pH 7.0高14.0%、9.1%、10.4%和11.4%、6.5%、7.2%。固體培養(yǎng)基pH 6.0，菌絲產(chǎn)生的漆酶活性顯著高于其他pH，pH 6.0時(shí)漆酶活力分別比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0高5.3%、6.6%和9.0%。由此可見，不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基下，適當(dāng)提高pH均可提高香菇漆酶活性。固化培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基優(yōu)化的pH為6.5，固化培養(yǎng)基為pH 6.0。

2.2 ?不同培養(yǎng)基狀態(tài)下pH對(duì)滑菇漆酶活性的影響

表2可知，3種不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基下，pH對(duì)滑菇漆酶活性均有較大影響。固化培養(yǎng)基pH 5.5與pH 7.0差異不顯著，其余pH間差異均顯著。3種不同培養(yǎng)基pH為6.0時(shí)滑菇菌絲產(chǎn)生的漆酶活力顯著高于其他不同pH，即pH 6.0能顯著提高滑菇的漆酶活性。固化培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基pH 6.0時(shí)漆酶活力分別比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0提高18.6%、7.8%、25.9%，94.9%、251.2%、433.4%和3.1%、5.8%、9.8%。3種不同培養(yǎng)基的適當(dāng)提高pH均可提高滑菇漆酶活力，最佳酸堿度均為pH 6.0。

2.3 ?不同培養(yǎng)基狀態(tài)下pH對(duì)金針菇漆酶活性的影響

表3可知，3種不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基下，pH對(duì)金針菇漆酶活性均有較大影響。液體培養(yǎng)基pH 5.5與pH 7.0、固體培養(yǎng)基pH 6.0與pH 7.0差異不顯著，與其他所有pH間差異顯著。固化培養(yǎng)基pH 7.0，金針菇菌絲產(chǎn)生的漆酶活力顯著高于其它配方，分別比pH 5.5、pH 6.0和pH 6.5高75.1%、42.2%和21%;液體培養(yǎng)基pH 6.0時(shí)漆酶活力顯著高于其他配方，分別比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0高3.4倍、1.6倍和3.1倍。固體培養(yǎng)基pH 6.5時(shí)，金針菇菌絲產(chǎn)生的漆酶活性顯著高于其它配方，分別比pH 5.5、pH 6.0和pH 7.0高35.9%、12.2%和9.9%。由此可見，不同狀態(tài)的培養(yǎng)基適當(dāng)提高pH值均可提高金針菇漆酶活性。最佳產(chǎn)漆酶活力酸堿度各不同，固化培養(yǎng)基為pH 7.0，液體培養(yǎng)基為pH 6.0，固化培養(yǎng)基為pH 6.5。

3 ?討論

不同pH對(duì)3種食用菌漆酶活性均有一定影響，適當(dāng)提高pH可提高3種不同食用菌漆酶活性，影響程度與培養(yǎng)基物理狀態(tài)也有關(guān)，表明培養(yǎng)料酸堿度是影響漆酶活性的重要環(huán)境因素。香菇在固化培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)pH 6.5時(shí)具有最高漆酶活性，固體培養(yǎng)基pH為6.0;滑菇采用不同狀態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，pH 6.0漆酶活性均為最高;金針菇最高漆酶活性在固化培養(yǎng)基為pH 7.0，液體培養(yǎng)基為pH 6.0，固體培養(yǎng)基為pH 6.5。

3種供試菌類在3種不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基下培養(yǎng)，其漆酶活性最優(yōu)pH均不完全相同，但均在該種菌適宜的菌絲生長范圍[21]。本研究液體培養(yǎng)基培養(yǎng)香菇最高漆酶活力所要求的pH與鹿桂花等[22]的液體培養(yǎng)香菇相一致;滑菇適當(dāng)提高pH至6.0漆酶活性最高，這與張福元等[23]液體培養(yǎng)滑菇時(shí)最高生物量pH相一致;劉蘋等[20]研究液體培養(yǎng)金針菇最高漆酶活力的pH為6.0，與本研究相吻合。

固體培養(yǎng)基時(shí)金針菇最高漆酶活力的pH與課題組金針菇工廠化栽培菌絲生長最快、產(chǎn)量最高的pH一致[24]，顯示漆酶與食用菌菌絲生物量、菌絲生長速度以及子實(shí)體產(chǎn)量等密切相關(guān)。此外，由于木霉、鏈孢霉等食用菌的常見雜菌多適宜在較低酸堿度的培養(yǎng)基中生長，提高培養(yǎng)基酸堿度有利于雜菌的控制，但其對(duì)香菇、滑菇產(chǎn)量及質(zhì)量的影響有待后續(xù)研究。須指出的是本研究只測試了菌絲個(gè)別生長階段的漆酶活性，但漆酶在菌絲不同生長時(shí)期的活力是變化的，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步對(duì)菌絲不同生長時(shí)期的漆酶進(jìn)行持續(xù)測定，以期為3種食用菌的培養(yǎng)料微堿化栽培提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Yoshida H. Chemistry of lacquer （urushi） Part I[J]. Journal of the Chemical Society， 1883， 43（1）： 472-486.

[2] Bertrand G. Preparation biochimique du sorbose[J]. Comptes Rendus Hebdomadaires Des Seances De IAcademie Des Sciences， 1896（122）： 900-903.

[3] 鈔亞鵬， 錢世鈞. 真菌漆酶及其應(yīng)用[J]. 生物工程進(jìn)展， 2001， 21（5）： 23-28.

[4] 曹明樂， 張海波， 黃 ?峰， 等. 漆酶的研究進(jìn)展[J]. 山東林業(yè)科技，2012， 42（3）： 106-115， 127.

[5] 陳小敏， 吳海冰， 向泉桔， 等. 不同溫度培養(yǎng)對(duì)香菇漆酶活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 56（1）： 155-160.

[6] 張 ?敏， 肖亞中， 龔為民. 真菌漆酶的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 生物學(xué)雜志， 2003， 20（5）： 6-8.

[7] 唐 ?菊， 段傳人， 黃友瑩， 等. 白腐菌木質(zhì)素降解酶及其在木質(zhì)素降解過程中的相互作用[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2011（10）： 32-36.

[8] 孫淑靜， 郭艷艷， 吳曉華， 等. 不同食用菌品種產(chǎn)漆酶規(guī)律的研究[J]. 中國食用菌， 2014， 33（3）： 38-40.

[9] 任鵬飛， 任海霞， 曲 ?玲， 等. 香菇胞外酶活性變化及其與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（12）： 11-14.

[10] Bollag J M， Shuttleworth K L， Anderson D H. Laccase-mediated detoxification of phenolic compounds[J]. Applied & Environmental Microbiology， 1988， 54（12）： 3086- 3091.

[11] 嚴(yán)培蘭， 高君輝. 黑木耳的抗霉能力、產(chǎn)量性狀與不同胞外酶活的相關(guān)性[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1998（S1）： 3-5.

[12] 司 ?靜， 李 ?偉， 崔寶凱， 等. 真菌漆酶性質(zhì)、分子生物學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2011（2）： 48-55.

[13] 韓美玲， 杜 ?娟， 安 ?琪， 等. 不同栽培基質(zhì)對(duì)糙皮側(cè)耳不同發(fā)酵方式下產(chǎn)漆酶活性的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2018， 37（8）： 1100-1108.

[14] 安 ?琪， 吳雪君， 吳 ?冰， 等. 不同碳源和氮源對(duì)金針菇降解木質(zhì)纖維素酶活性的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2015， 34（4）： 761-771.

[15] 韓美玲， 安 ?琪， 吳雪君， 等. 不同木質(zhì)纖維素誘導(dǎo)對(duì)糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活性的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2017， 36（3）： 349-357.

[16] 肖冬來， 張 ?迪， 林衍銓， 等. 金屬離子對(duì)香菇纖維素酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響[J]. 中國食用菌， 2018， 37（3）： 56-58.

[17] 王偉科， 陸 ?娜， 周祖法， 等. 8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 1（4）： 498-501.

[18] 胡傳琪， 江 ?潔， 陳靜慧， 等. 以秸稈為基料富鋅栽培滑菇的纖維素酶和漆酶的變化規(guī)律[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015， 41（4）： 121-124.

[19] 劉 ?蘋， 唐志紅， 李夢玉， 等. 金針菇漆酶活性測定的最佳反應(yīng)條件及液體培養(yǎng)胞外酶的研究[J]. 食品科技， 2012， 37（6）： 14-17.

[20] 劉 ?蘋， 李 ?剛， 溫少紅. 金針菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件的研究[J]. 食品科學(xué)， 2012， 33（21）： 226-230.

[21] 黃 ?毅. 食用菌栽培[M]. 3版. 北京： 高等教育出版社， 2008.

[22] 鹿桂花， 周海燕， 陳恒雷， 等. 武香一號(hào)香菇液體發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)， 2008（2）： 79-82.

[23] 張福元， 郭來鎖， 薛義芳， 等. 滑菇液體培養(yǎng)營養(yǎng)條件及培養(yǎng)適期研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào)， 1998， 5（3）： 3-5.

[24] 張維瑞， 劉盛榮， 蘇貴平， 等. 微堿化栽培料對(duì)金針菇產(chǎn)量和質(zhì)量的提升效應(yīng)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2019， 40（3）： 22-27.

收稿日期 ?2019-10-15;修回日期 ?2020-01-21

基金項(xiàng)目 ?福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（No. 2016N0027）;福建省教育廳省屬高?？蒲袑ｍ?xiàng)項(xiàng)目（No. JK2015055）;“精準(zhǔn)扶貧與反返貧研究中心”智庫項(xiàng)目。

作者簡介 ?張維瑞（1966—），男，本科，教授，推廣研究員，研究方向：食用菌栽培及病蟲害防治，E-mail：zhang.w.r@163.com。