王容，趙良忠*，李明 ,4，孫孟京 ，謝春平 ，鄧雅欣 ，歐紅艷

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽,422000) 2(豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地，湖南 邵陽,422000) 3(湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南 邵陽,422000) 4(廣州佳明食品科技有限公司，廣東 廣州,510000)

貴州地域天氣溫潤，腹瀉、痢疾等疾病比較常見。食酸成為貴州人民特有的飲食習(xí)慣，其中以酸湯最為著名，故有“三天不吃酸，走路打串串”之說[1-2]。米酸湯味道清香爽口，沁人肺腑。除富含多種維生素和各類微量元素外，還富含氨基酸、有機(jī)酸等。

貴州的米酸湯一直采用自然發(fā)酵，周期長、產(chǎn)酸低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[3-5]。當(dāng)前大部分研究仍停留在對酸湯中的微生物進(jìn)行分離鑒定、酸湯發(fā)酵工藝優(yōu)化、營養(yǎng)特征物質(zhì)以及一些風(fēng)味物質(zhì)分析，忽略了對酸湯動(dòng)力學(xué)的研究[5-7]。雖然現(xiàn)在已有學(xué)者以苗族地區(qū)農(nóng)家自釀的酸湯為原料，對其中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，研究其生物學(xué)特性，建立了單一菌種的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型[8]，但對米酸湯混合乳酸菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、玉米乳桿菌(L.zeae)、植物乳桿菌(L.plantarum)為混合菌種發(fā)酵米酸湯，研究其在發(fā)酵過程中品質(zhì)的變化和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從豆清液中分離出3株產(chǎn)酸高的Lactobacillusrhamnosus、L.zeae、L.plantarum,由豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室提供；大米、糯米,市售；液化酶(酶活4 000 u/g)、糖化酶(酶活120 000 u/g),廣東溢多利生物科技股份有限公司提供；乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸,均為色譜純,北京索萊寶科技有限公司提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺，江蘇通凈有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)，島津公司；GI54DWS型全自動(dòng)滅菌鍋、le204e型電子天平，長沙艾迪生物科技有限公司；DH-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋、VELOCITY18R型臺式冷凍離心機(jī)，澳大利亞達(dá)卡米公司；U-3 000高效液相色譜，天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；CR-400色彩色差計(jì)，廣東七彩儀器設(shè)備有限公司；NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)、電子鼻和電子舌，上海瑞玢科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米酸湯發(fā)酵(圖1)

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

(1)浸泡：稱取m(面粉)∶m(大米)∶m(糯米)=2∶1∶1共100 g，凈水洗滌1～2次，在室溫25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸泡約6 h。

(2)糊化：加900 g去離子水進(jìn)行磨漿，再將磨好的米漿加熱到100 ℃并保溫5 min。

(3)液化：在溫度降為85 ℃時(shí)，調(diào)pH值到6.5，添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的液化酶，液化25 min。

(4)糖化：在溫度降為55 ℃時(shí)，調(diào)pH值到4.0時(shí)，添加0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的糖化酶，糖化1 h。

(5)滅菌：105 ℃、8 min進(jìn)行滅菌。

(6)接種：把從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活化、擴(kuò)培、馴化的混合菌，按接種量為5%(V/V)接種于待發(fā)酵液中。

(7)發(fā)酵：搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度36 ℃，每隔6 h取樣測其有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、黏度、色差、pH值、感官評分、菌體含量、乳酸含量、殘?zhí)菨舛鹊闹笜?biāo)變化。

1.2.2 總酸含量測

參照國標(biāo)《GBT 12456—2008食品中總酸的測定》[9]。

1.2.3 菌體含量測定方法

用移液槍吸取10 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用去離子水洗滌3次后，于105 ℃烘干至恒重，稱菌體質(zhì)量[10-11]。

1.2.4 殘?zhí)橇繙y定

按照3,5-二硝基水楊酸法測定[12]。

1.2.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

參照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[13]的凱氏定氮法。

1.2.6 有機(jī)酸測定[14]

取米酸湯10 mL，經(jīng)過濾后在10 000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣供分析用。液相色譜條件：色譜柱為CAPECELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(pH=

2.65 0.01 mol/L KH2PO4溶液)=5∶95；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

分別準(zhǔn)確稱取草酸10 mg、蘋果酸10 mg、檸檬酸10 mg、乳酸10 mg。用重蒸水溶解并分別定容到4個(gè)10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)酸原液，密封置于4 ℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸標(biāo)樣。采集數(shù)據(jù)，根據(jù)峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系建立線性回歸方程，見表2和圖2。

1.2.7 色差值

用移液槍準(zhǔn)確移取混勻的米酸湯2 mL，以蒸溜水為對照，測定米酸湯的L*(亮度)、a*(紅綠度，正值為紅色,負(fù)值為綠色)、b*值(黃藍(lán)度，正值為黃色，負(fù)值為藍(lán)色)，然后按照公式(1)求出ΔE值，ΔE越大表示樣品顏色差異越大。

(1)

1.2.8 黏度測定

量取20 mL米酸湯，采用NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行測試。

1.2.9 感官評定

由10名有經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)評員組成評定小組，分別對米酸湯的色澤、內(nèi)部形態(tài)、滋味和香氣進(jìn)行評定，采用百分制，具體的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

1.2.10 米酸湯發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型建立

1.2.10.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)方程

在菌體生長動(dòng)力學(xué)模型中，最為常用的是Monod和Logistic模型[15-16]，Monod主要用來描述密度較低和生長較慢的菌體，但混合乳酸菌生長較快，到發(fā)酵后期菌體濃度很大，采用Monod方程不合適，所以采用描述生長曲線為S形的Logistic模型。結(jié)合參考文獻(xiàn)[17-18]，對本實(shí)驗(yàn)中不同階段的混合乳酸菌采用如下方程：模擬菌體生長變化，Logistic 方程[19]；模擬乳酸生成，Luedeking-piret 方程[20]；模擬總糖的消耗，Luedeking-piret 方程[21]。

Logistic方程求積分式見公式(2)：

(2)

式中：CX,菌體生物量,g/L；t,時(shí)間；k,微生物的最大比生長速率；Cm,菌體最大生物量,g/L；C0,菌體的初始生物量,g/L。

1.2.10.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)方程

本實(shí)驗(yàn)采用Luedeking-piret方程[22-23]。通用模型方程如公式(3)：

(3)

式中：P,產(chǎn)酸量,g/L；P0,初始乳酸量,g/L；t，時(shí)間，h；n1，與菌體量有關(guān)的合成系數(shù)[g/(g細(xì)胞·h)]；n2，與菌體生長有關(guān)的合成系數(shù)(g/g 細(xì)胞)。

1.2.10.3 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程

本實(shí)驗(yàn)中由于混合乳酸菌的生長和產(chǎn)物生成是部分偶聯(lián)型，則采用Luedeking-piret方程[24-26]。

(4)

式中：S,底物質(zhì)量濃度,g/L；S0,初始底物質(zhì)量濃度,g/L；t,時(shí)間,h；r2,底物用于菌體生長的得率系數(shù),g/g；r1,微生物的維持常數(shù)，h-1。

1.2.11 電子鼻及電子舌測定風(fēng)味物質(zhì)

電子鼻測定:將電子鼻傳感器預(yù)熱0.5 h以上，使其達(dá)到工作溫度，稱取5 mL樣品于玻璃進(jìn)樣瓶中，加蓋密封待檢。待進(jìn)樣瓶中的樣品達(dá)到液-氣兩相平衡后，對所需檢測的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，設(shè)置采樣時(shí)間為120 s，氣體流量為0.3 L/min，等待時(shí)間為10 s，清洗時(shí)間為120 s，每個(gè)樣品重復(fù)4次。

電子舌測定:將電子鼻傳感器預(yù)熱0.5 h以上，使其達(dá)到工作溫度，對電子舌傳感器進(jìn)行完全地清洗，以免影響試驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)的采集，清洗溶液為去離子水。清洗完成后，設(shè)定測定時(shí)所需要的相應(yīng)參數(shù)，量取15 mL待測樣品倒入電子舌專用燒杯中，對樣品進(jìn)行檢測。采樣時(shí)間180 s，采樣速度為1次/s，每個(gè)樣品平行測定5次。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，且每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)與相關(guān)性分析，應(yīng)用Origin 9進(jìn)行擬合求解。

2 結(jié)果與分析

2.1 米酸湯在發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化結(jié)果分析

如表4所示，在米酸湯隨著發(fā)酵時(shí)間變化過程中所檢測的4種有機(jī)酸中，乳酸含量最高，在發(fā)酵后期達(dá)到了10.360 g/L，酒石酸和蘋果酸含量次之，在發(fā)酵后期分別達(dá)到了0.191、0.194 g/L。檸檬酸有檢測出，但在發(fā)酵后期含量極少，基本沒有。乳酸在0～24 h內(nèi)隨發(fā)酵時(shí)間增長緩慢，在24～102 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，102 h后隨發(fā)酵時(shí)間基本保持不變。酒石酸的生成曲線基本與乳酸一致，檸檬酸在0～60 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，在60～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢，在96 h之后檸檬酸含量基本為0。蘋果酸在18 h之前含量基本為0，在18～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈上升趨勢，在96 h之后基本保持不變，略有下降趨勢。圖3為120 h時(shí)米酸湯中有機(jī)酸色譜圖。

注：結(jié)果為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。下同。

2.2 米酸湯在發(fā)酵過程中感官評分、蛋白質(zhì)、黏度、色差值和pH值變化結(jié)果分析

如表5所示，在米酸湯發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)、黏度、pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化都呈下降的趨勢，色差值和感官評分都呈上升的趨勢。蛋白質(zhì)在0～12 h隨發(fā)酵時(shí)間下降比較緩慢，在12～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在102 h之后，蛋白質(zhì)基本在0.81 g/100 g左右保持不變。黏度在0～12 h隨發(fā)酵時(shí)間下降緩慢，在12～102 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在108 h之后，黏度基本在2.7 mPa·s左右，變化非常小。pH值在0～24 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在24 h之后隨發(fā)酵時(shí)間下降緩慢，在發(fā)酵后期基本保持不變。感官評分在0～102 h隨發(fā)酵時(shí)間直線上升，在102 h到達(dá)最高,為(90.38±0.16)分，之后便保持不變。

2.3 米酸湯在發(fā)酵過程中品質(zhì)相關(guān)性分析

根據(jù)表6進(jìn)行的米酸湯品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析表明：感官評分與乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.983、0.914、0.796)，即酸度越高，米酸湯感官評分越高；與色差值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.979)，即色差值越大，米酸感官評分越高，可能原因是微生物產(chǎn)生的酶將蛋白質(zhì)降解成氨基酸,糖類降解成單糖,兩者發(fā)生了Mailard反應(yīng)，產(chǎn)生了類黑精等物質(zhì)，使顏色發(fā)生變化，影響米酸湯的色澤，從而影響感官評分；感官評分與蛋白質(zhì)、黏度和pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.983、-0.987、-0.741)。黏度與蛋白質(zhì)、pH值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.989、0.689)；黏度與感官評分、色差值、乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r為-0.987、-0.953、-0.993、-0.898、-0.713)；一方面可能是混合菌在發(fā)酵過程中，未被水解的直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例發(fā)生改變,降解了淀粉中的支鏈淀粉，另一方面可能是蛋白質(zhì)大分子在混合乳酸菌的作用下水解成小分子的肽、氨基酸殘基等小分子物質(zhì)，使黏度下降，從而影響米酸湯的內(nèi)部形態(tài)和口感。綜上所述，米酸湯在發(fā)酵過程中品質(zhì)指標(biāo)間有著非常復(fù)雜的聯(lián)系。

注：**在P<0.01上差異極顯著。

2.4 米酸湯發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

混合乳酸菌在米酸湯中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示。

混合乳酸菌發(fā)酵周期為120 h，混合乳酸菌的生產(chǎn)過程隨發(fā)酵變化可分為4個(gè)階段。0～8 h為延滯期，菌體增長速度緩慢，總酸合成速度比較低，殘?zhí)堑南乃俣纫脖容^低；8～48 h后進(jìn)入對數(shù)期，碳源充足，菌體快速生長，呈直線上升，殘?zhí)窍囊布涌欤偹岷砍掷m(xù)增多；48～108 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體繁衍后代的速度逐漸下降，相對菌體死亡數(shù)開始漸漸增加，此時(shí)菌體繁衍子代的數(shù)量與死亡數(shù)漸漸達(dá)到平衡，米酸湯的pH值低，抑制了菌體生長，殘?zhí)窍幕静蛔?，乳酸合成速度降低，總酸含量基本保持不變?08 h之后菌體含量呈下降模式，進(jìn)入衰亡期。

2.5 模型擬合求解與檢驗(yàn)

2.5.1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)擬合求解

利用Origin 9對方程(2式)進(jìn)行線性擬合，得到的方程為：y=0.175 6x-3.685，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 6。由此可得k=0.175 6，Cm=0.122 4。

利用Origin 9將菌體生長穩(wěn)定期乳酸含量與時(shí)間進(jìn)行線性擬合，得到方程式為：P=0.097 2t+1.192 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5，由此可得n1=0.019 4。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，n1=0.019 4，P0=0.62，代入方程(3式)并過(0，0)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到方程為y=0.535 9x+0.028 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，由此可得n2=0.535 9。

利用Origin 9取菌體生長穩(wěn)定時(shí)期，將基質(zhì)殘?zhí)菨舛萐與時(shí)間t進(jìn)行線性擬合得到：S=-0.044 9t+12.318，相關(guān)系數(shù)R2=0.881 4，得到r1=0.009。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，r1=0.009，S0=19.15，代入方程(4式)并過(0，0)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到方程為y=1.665 8x+0.416 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，由此可得r2=0.166 5(表7)。

將各參數(shù)及初始條件值代入模型(2)式、(3)式、(4)式得：

菌體生長動(dòng)力學(xué)模型：

乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型：

殘?zhí)窍膭?dòng)力學(xué)模型：

S=50.03-1.485×

2.5.2 模型驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的真實(shí)性，用Origin 9得到混合乳酸菌發(fā)酵過程的擬合曲線，如圖5所示。從圖5中可以看出3個(gè)模型的模型值與實(shí)驗(yàn)值擬合曲線比較理想。模型的相關(guān)性均在0.01水平(雙側(cè))顯著相關(guān)，菌體生長動(dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.998**；乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.999**；殘?zhí)窍膭?dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.992**。較好地反應(yīng)了實(shí)際的發(fā)酵過程，表明了模型對米酸湯發(fā)酵過程具有一定的指導(dǎo)意義。

2.6 米酸湯成分測定

混合菌發(fā)酵米酸湯(本研究混合菌發(fā)酵米酸湯發(fā)酵4 d時(shí)的樣品)、自然發(fā)酵米酸湯(不加入混合菌自然發(fā)酵的樣品)、貴州米酸湯產(chǎn)品(市場上購買的貴州米酸湯產(chǎn)品)各組分含量見表8。混合發(fā)酵米酸湯總酸低于貴州米酸湯產(chǎn)品，其有機(jī)酸(乳酸、酒石酸)、還原糖均高于自然發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品。與自然發(fā)酵米酸湯對比，混合發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、乳酸含量均有提高，乳酸占總酸的比例分別是95.98%、71.08%、28.86%，可見，混合發(fā)酵米酸湯中有機(jī)酸含量最多，都是通過發(fā)酵生成的有機(jī)酸，而貴州米酸湯產(chǎn)品中有機(jī)酸(以乳酸計(jì))只占總酸的28.86%，推測可能是后期發(fā)酵完調(diào)配了一些無機(jī)酸。

注：a,b,c代表不同水平之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.7 風(fēng)味結(jié)果分析

2.7.1 電子鼻

圖6為3種米酸湯的主成分分析(principal component analysis，PCA)，由圖6可知，第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為98.6%，第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為1.1%，二者之和達(dá)到99.7%,大于95%，因此可認(rèn)為此主成分二維圖能很好地表示出被測樣品的整體信息且成分間干擾小。其區(qū)分度(discrimination index，DI)達(dá)91.8%，一般情況下認(rèn)為DI值大于80%區(qū)分效果較好，DI值越大表示樣品間的距離越遠(yuǎn)，區(qū)分的效果越理想。由此可見，3種不同的米酸湯揮發(fā)性風(fēng)味成分有明顯區(qū)別。

2.7.2 電子舌

圖7表示3種米酸湯的PCA，由圖7可知，PC1的貢獻(xiàn)率為33.84%，PC2的貢獻(xiàn)率為18.51%，二者之和達(dá)到63.56%,小于95%，因此可認(rèn)為此主成分二維圖不能很好地表示出被測樣品的整體信息且成分間干擾大。其DI達(dá)90.27%，由此可見，3種不同的米酸湯的風(fēng)味成分有明顯區(qū)別。

3 結(jié)論

通過比較研究米酸湯在發(fā)酵過程中感官評分、蛋白質(zhì)、色差值、pH值和有機(jī)酸可知，米酸湯品質(zhì)指標(biāo)間有著非常復(fù)雜的相關(guān)性。

在米酸湯發(fā)酵過程當(dāng)中，描繪了混合乳酸菌株菌發(fā)酵的菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)曲線；并通過Origin 9非線性擬合得出菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型；通過比較菌體生長、乳酸合成和總糖消耗模型的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值，結(jié)果表明以上模型能夠較好地反映發(fā)酵情況，對后續(xù)的放大試驗(yàn)有一定的指導(dǎo)意義。

通過比較混合菌發(fā)酵米酸湯、自然發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品的組分發(fā)現(xiàn)，混合菌發(fā)酵米酸湯的乳酸、酒石酸、總酸、蛋白質(zhì)、還原糖均高于自然發(fā)酵米酸湯，總酸低于貴州米酸湯產(chǎn)品，但(乳酸∶總酸)高于貴州米酸湯產(chǎn)品。電子鼻、電子舌可有效區(qū)分不同米酸湯產(chǎn)品的風(fēng)味特征，作為米酸湯風(fēng)味分析的一種手段。