劉鋒，謝晶

(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)屬于鰈形目鲆科，在我國被稱作“多寶魚”，作為我國北方主要的海水養(yǎng)殖魚類，年產(chǎn)量達(dá)8.5萬t，銷售價值超過40億元人民幣[1]。大菱鲆因其高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)豐富等特點為消費者喜愛[2]。目前，大菱鲆以活魚銷售為主，隨著生鮮電商的迅猛發(fā)展，冰鮮大菱鲆已成為未來銷售流通的重要途徑之一。然而，由于受到微生物繁殖和體內(nèi)酶活性的影響，大菱鲆在貯藏期間易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化和降解，導(dǎo)致魚肉品質(zhì)劣變，產(chǎn)品貨架期縮短。

近年來，涂膜作為一種新型安全的保鮮方法得到了外界廣泛的關(guān)注。其中，復(fù)合涂膜技術(shù)發(fā)展迅速，具有加強(qiáng)涂膜抑菌和抗氧化等方面的性能，是一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全的保鮮方法[3]。亞麻籽膠(flaxseed gum，F(xiàn)SG)因具有良好的成膜性、功能特性和營養(yǎng)價值而成為一種具有廣泛前景的成膜材料[4]。YOUSUF等[5]將亞麻籽膠與檸檬草精油結(jié)合處理即食石榴，結(jié)果表明，相比于對照組，用亞麻籽膠-檸檬草精油復(fù)合涂膜處理顯著抑制了微生物的生長，并且更好地保持了石榴的色澤和水分。檸檬馬鞭草精油(verbena oil)是一種由檸檬馬鞭草萃取而制得的植物精油，主要成分為檸檬醛、苧烯和芳姜黃烯，具有很強(qiáng)的抗氧化和抗菌能力[6-7]。ISHKEH等[7]用檸檬馬鞭草精油處理樹莓果實，發(fā)現(xiàn)用檸檬馬鞭草精油處理的樹莓果實具有較高的抗氧化能力、酚類和花青素含量，抑制了真菌的生長，延長了果實的貨架期。因此，將亞麻籽膠與檸檬馬鞭草精油復(fù)合使用涂膜就能夠既具備良好的成膜性，又具有強(qiáng)抑菌和抑制蛋白氧化的效果，延長產(chǎn)品貨架期。

本研究利用不同濃度的檸檬馬鞭草精油結(jié)合亞麻籽膠制作復(fù)合涂膜液處理冰溫貯藏下的大菱鲆魚片，研究冰溫貯藏期間大菱鲆肌原纖維蛋白生化特性及結(jié)構(gòu)的變化，以期篩選出一種有效的檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜的配方，為今后的大菱鲆保鮮提供一種全新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

1.1.1 實驗試劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、馬來酸、KCl、三氯乙酸、尿素、SDS、EDTA、DTNB、CaCl2、戊二醛、甘油、無水乙醇、KBr、二甲胂酸鈉、四氧化鋨、環(huán)氧樹脂、乙酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，生工生物工程(上海)股份有限公司；Bradford法蛋白測試盒、超微量Ca2+-ATP酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；檸檬馬鞭草精油，廣州粵渝精油公司；亞麻籽膠(食品級)，河南萬邦實業(yè)有限公司。

H1850R型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XEBJ-1000超聲波均質(zhì)機(jī)，濟(jì)寧諧成超聲波設(shè)備有限公司；DJ1C-60增力電動攪拌器，青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司；FEI Tecnai G2 SpiritBiotwin透射電子顯微鏡，美國Thermo Scientific公司；Hitachi L-8800全自動氨基酸分析儀，天美(中國)科學(xué)儀器有限公司；Hitachi F-7100熒光分光光度計，上海斯邁歐分析儀器有限公司；BOC Edwards Lyofast真空冷凍干燥機(jī)，北京天利聯(lián)合科技有限公司；BioTek多功能酶標(biāo)儀，上海京工實業(yè)有限公司；BPS-100CB恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜的制備及魚樣的處理

將亞麻籽膠粉末以0.6%的質(zhì)量濃度溶解在蒸餾水中[5]，使用磁力攪拌器以3 000 r/min勻速攪拌3 h，加入甘油(25%，w/v)進(jìn)行適當(dāng)乳化，待溶液冷卻后，將檸檬馬鞭草精油分別以0、0.128%、0.64%和1.28%的質(zhì)量濃度滲入到FSG溶液中繼續(xù)以3 000 r/min勻速攪拌0.5 h，最后在超聲波均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)0.5 h，制得檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜液。

鮮活大菱鲆于2019年6月購于上海市蘆潮港水產(chǎn)品批發(fā)市場，體態(tài)均勻、健康，每條大菱鲆的平均體重為(700±50)g，平均體長為(30±2)cm。活魚宰殺后，去除魚鰓和內(nèi)臟，清洗干凈后把魚體切分成質(zhì)量大小均一的魚塊。

分別對魚塊進(jìn)行浸泡，浸泡時間為3 min。未涂膜處理的魚塊作為對照組CK，僅用FSG溶液涂覆的樣品為實驗組C1，用滲入0.128%、0.64%和1.28%質(zhì)量濃度檸檬馬鞭草精油的FSG溶液涂覆的樣品為實驗組C2，C3和C4。魚樣瀝干后隨機(jī)分裝在聚乙烯袋中，-1 ℃下貯藏，每隔5 d取一次樣。

1.2.2 肌原纖維蛋白的制備與含量測定

參考LV等[8]的方法提取肌原纖維蛋白溶液(myofibril protein，MP)。稱取2 g剁碎的魚肉于50 mL離心管中，加入20 mL緩沖液A(20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.05 mol/L KCl)，4 ℃下勻漿，勻漿液以10 000 r/min離心15 min，收集沉淀。沉淀加入20 mL緩沖液B(20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.6 mol/L KCl)，勻漿后于4 ℃下浸提1 h，10 000 r/min離心15 min，上清液即肌原纖維蛋白溶液。根據(jù)Bradford試劑盒法測定蛋白濃度。

人本主義治療模式與行為主義治療模式存在顯著的差異，這種差異也暗示了人在社會上的地位水平具有明顯的轉(zhuǎn)變。該種治療模式突出了人的價值，具有“以人為本”的治療特征，認(rèn)為人與動物或機(jī)器是具有明顯差異的，人具有自己的主觀世界，并堅信，人可以通過自己的能力駕馭周圍所發(fā)生的事情。認(rèn)為人具有自我選擇的權(quán)利，強(qiáng)調(diào)人的尊嚴(yán)。這種治療模式具有人性化特征，具有積極樂觀的態(tài)度，與精神分析治療模式及行為治療模式有明顯的差異。

1.2.3 總巰基含量的測定

參照BENJAKUL等[9]的方法測定。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性的測定

根據(jù)魯耀彬等[10]的方法測定。

1.2.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

根據(jù)LI等[11]的方法，將MP干粉樣品與KBr充分混合并研磨，然后用Thermo FT-IR光譜儀在25 ℃下掃描整個條帶，將每個樣品的紅外光譜圖設(shè)置為32次掃描的疊加，儀器分辨率為4 cm-1，每個樣品以空氣為背景進(jìn)行掃描。實驗進(jìn)行3次測量。用Omnic 9.2.106光譜軟件處理FT-IR原始數(shù)據(jù)，用Peckfit v4.12光譜分析擬合軟件對譜峰進(jìn)行擬合。

1.2.6 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

根據(jù)SUN等[12]的方法，稍作修改。使用F-7100熒光分光光度計測量蛋白質(zhì)溶液的固有熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長為295 nm，狹縫寬度為5 nm，發(fā)射光譜范圍為310～400 nm，掃描速度為1 200 nm/min。記錄熒光發(fā)射光譜的最大熒光波長。

1.2.7 游離氨基酸含量的測定

參照YU等[13]的方法進(jìn)行。使用Hitachi L-8800全自動氨基酸分析儀分析。

1.2.8 透射電子顯微鏡觀察

參照CHEN等[14]的方法，稍作修改。將各樣品沿著平行于肌原纖維的方向切成5 mm×3 mm×2 mm的方形小塊，用預(yù)冷的2.5%體積濃度戊二醛固定并置于0.1 mol/L磷酸緩沖液中(pH 7.4)，然后將樣品在pH 7.4的二甲胂酸鈉緩沖液中洗滌，四氧化鋨固定2 h。然后，樣品分別經(jīng)30%、50%和70%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇梯度脫水，在環(huán)氧丙烷中交換后包埋在Spurr樹脂中，使用超薄切片機(jī)平行切割纖維。超薄切片(70 nm)用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，最后使用FEI Tecnai G2 SpiritBiotwin透射電子顯微鏡拍照觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上每個指標(biāo)做3次平行實驗，采用Origin 8.5繪圖，并利用SPSS Statistics 24軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總巰基含量的變化

巰基是蛋白質(zhì)中最主要的官能團(tuán)之一，其含量變化是評價肌肉蛋白質(zhì)氧化的有效指標(biāo)[15]。如圖1所示，隨著貯藏時間的增加，所有組樣品的巰基含量均不斷下降，這是因為貯藏期間巰基發(fā)生氧化形成二硫鍵[16]。CK組的巰基含量在整個貯藏期間下降迅速，貯藏至15 d時，CK組的巰基含量下降了38.74%，而C1、C2、C3和C4組的巰基含量分別下降了32.31%、16.70%、22.25%和23.68%，結(jié)果表明，涂有檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜樣品的巰基含量要顯著高于其他組(P<0.05)，這可能是因為復(fù)合涂膜里的檸檬馬鞭草精油具有較強(qiáng)抗氧化能力，抑制了巰基的氧化，從而保護(hù)蛋白質(zhì)免于變性。另外，C2組的巰基含量在貯藏結(jié)束時顯著高于C3和C4組(P<0.05)，這可能是因為較高濃度的檸檬馬鞭草精油的促氧化作用引起的[17]。NIETO等[18]發(fā)現(xiàn)，與較低質(zhì)量濃度(0.05%)相比，向豬肉餅中添加更高質(zhì)量濃度(0.4%)的牛至精油會導(dǎo)致更高的蛋白質(zhì)氧化。因此，以上結(jié)果表明添加0.128%(質(zhì)量濃度)檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜能更有效地抑制肌肉蛋白質(zhì)的氧化。

2.2 Ca2+-ATPase活性的變化

Ca2+-ATPase活性是用來評價肌球蛋白完整性的指標(biāo)，蛋白質(zhì)的變性會導(dǎo)致酶活力發(fā)生改變[19]。圖2顯示了不同處理組的大菱鲆的Ca2+-ATPase活性在整個貯藏期間的變化，可以得出，隨著貯藏時間的增加，所有組的Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢，這可能是由于肌球蛋白的球狀頭部上的巰基發(fā)生氧化和肌球蛋白的聚集引起的[20]。其中，相比于其他處理組的樣品，對照組樣品的Ca2+-ATPase活性急劇下降，貯藏至15 d時，其Ca2+-ATPase活性從0.148降低至0.1 μmol Pi/(mg protein·min)，顯著低于用亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品(P<0.05)。貯藏30 d后，C2組樣品的Ca2+-ATPase活性顯著高于其他處理組的樣品(P<0.05)，這可能是因為這種復(fù)合涂膜能更有效地抑制肌球蛋白中的巰基發(fā)生氧化，該結(jié)果與總巰基含量的變化保持一致。

YU等[13]將不同濃度的丁香精油與殼聚糖涂膜結(jié)合處理草魚，發(fā)現(xiàn)添加較高濃度精油的涂膜能更好地減弱氧化損傷，更好地保持魚片的完整性。然而，本實驗得到較低濃度的檸檬馬鞭草精油保護(hù)蛋白效果更佳，可能是因為高濃度的檸檬馬鞭草精油會引起促氧化作用。MARIO[21]等用迷迭香精油處理法蘭克福香腸時也發(fā)現(xiàn)迷迭香精油在低濃度時抗氧化效果更好。

2.3 大菱鲆肌原纖維蛋白的紅外光譜和二級結(jié)構(gòu)

圖4顯示了不同方式處理的大菱鲆肌原纖維的二級結(jié)構(gòu)的定量分析。新鮮魚樣包含37.62%的β-折疊、25.27%的無規(guī)則卷曲、16.85%的α-螺旋和20.26%的β-轉(zhuǎn)角。隨著貯藏時間的增加，α-螺旋的比例出現(xiàn)下降，β-折疊的比例上升，表明低溫下α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變[26]。其中，α-螺旋的減少可能與冰藏期間螺旋結(jié)構(gòu)的部分解折疊有關(guān)，包括維持二級結(jié)構(gòu)的氫鍵被破壞[27]。在貯藏結(jié)束時，用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品相比于空氣組的樣品，有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋和β-折疊)的總比例顯著增加(P<0.05)，表明這種復(fù)合涂膜在冰藏期間能夠很好地穩(wěn)定大菱鲆的肌原纖維結(jié)構(gòu)。并且，相比于僅用亞麻籽膠處理的樣品，復(fù)合涂膜處理能夠更好地促進(jìn)肌原纖維蛋白的穩(wěn)定化，這很可能是因為檸檬馬鞭草精油具有的強(qiáng)抗氧化性，保護(hù)蛋白被降解。ZHAO[28]等用魚明膠結(jié)合葡萄籽提取物處理羅非魚魚片，結(jié)果表明這種復(fù)合涂膜處理有助于羅非魚在貯藏期間維持更有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.4 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光是指蛋白質(zhì)分子內(nèi)的熒光基團(tuán)暴露在紫外線時發(fā)出熒光的現(xiàn)象。熒光強(qiáng)度的降低通常是因為發(fā)色團(tuán)在溶劑中或在蛋白質(zhì)自身中與猝滅劑發(fā)生相互作用，蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光轉(zhuǎn)移到表面，從而發(fā)生熒光猝滅[29]。因此，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的變化可以反映其構(gòu)象的變化[30]。色氨酸作為一種芳香族氨基酸，存在于蛋白質(zhì)內(nèi)核中，可以發(fā)出可通過熒光光譜法測定的熒光，它們的出現(xiàn)表明蛋白質(zhì)展開的程度[31]。冰溫貯藏期間經(jīng)不同處理方式處理的大菱鲆肌原纖維蛋白的熒光光譜如圖5所示。結(jié)果表明，第0天的新鮮魚樣在波長為336 nm處顯示出最高的熒光強(qiáng)度。對照組中大菱鲆肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在整個貯藏期間急劇下降，可能是因為大菱鲆在貯藏過程氧化嚴(yán)重，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開，色氨酸殘基等熒光物質(zhì)暴露在極性環(huán)境中，其內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低[32]。然而，用亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在貯藏前期下降較慢，尤其是C2組的下降速率要顯著低于其他組(P<0.05)，表明添加質(zhì)量濃度為0.128%檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜可以保護(hù)蛋白質(zhì)在冰溫貯藏期間免于變性和結(jié)構(gòu)的變化，提高大菱鲆的品質(zhì)。并且，貯藏結(jié)束時C3和C4組的熒光強(qiáng)度顯著低于C2組(P<0.05)，這是因為較高濃度的檸檬馬鞭草精油引起的促氧化作用加快了內(nèi)源熒光物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。SHI[31]等用迷迭香提取物作為上釉材料處理泥蝦，結(jié)果表明，與迷迭香釉蝦相比，未上釉蝦的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在整個貯藏期間急劇下降，表明上釉處理保護(hù)蛋白質(zhì)在冷凍貯藏期間免于結(jié)構(gòu)的變化。

2.5 游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸與魚片貯藏期間風(fēng)味的形成密切相關(guān)，一些游離氨基酸更是有害生物胺的前體[33]，如組氨酸在組氨去羧酶的作用下轉(zhuǎn)變成組胺。蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致了游離氨基酸的形成[34]，因此游離氨基酸的含量變化可以反映蛋白質(zhì)的降解程度。不同處理方式的大菱鲆冰溫貯藏0、15和30 d后游離氨基酸含量如表1所示。在整個貯藏期間，所有組大菱鲆的游離氨基酸的總含量均不斷增加，表明隨著貯藏時間的增加，大菱鲆因受到自身酶和微生物的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)被降解，其中CK組蛋白質(zhì)降解速度最快。而亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜抑制了蛋白質(zhì)的降解，并且C2組抑制效果最好，這可能是因為檸檬馬鞭草精油具有的強(qiáng)抗氧化性抑制了蛋白質(zhì)的降解。另外，CK組中的谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和組氨酸的含量在整個貯藏期間均高于其他處理組，作為異味氨基酸，較多的組氨酸含量會導(dǎo)致CK組中的大菱鲆產(chǎn)生更多的苦味，口味下降。SUN等[35]研究富含CUR/βCD乳液的魚明膠涂層對4 ℃下貯藏的草魚魚片的保鮮效果，結(jié)果表明，魚明膠涂層處理抑制了草魚蛋白質(zhì)的降解，并且經(jīng)魚明膠涂層處理的魚片風(fēng)味更佳。

注：同一貯藏時間不同組別之間不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 肌原纖維蛋白的超微結(jié)構(gòu)觀察

已有文獻(xiàn)[36]表明，肌原纖維的結(jié)構(gòu)變化是由幾種主要的肌原纖維蛋白(肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白等)降解而導(dǎo)致的。本研究主要觀察了第0天的新鮮樣品以及貯藏20 d后不同處理組樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)變化。如圖6-A所示，新鮮大菱鲆的肌原纖維結(jié)構(gòu)完整、肌節(jié)規(guī)則、肌絲條紋清晰，并且Z線、M線、A帶和I帶清晰可見。貯藏20 d后，對照組CK和僅用亞麻籽膠處理的C1組樣品的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，如圖6-B和圖6-C。對照組的肌原纖維結(jié)構(gòu)降解嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為Z線、M線基本消失，A帶和I帶嚴(yán)重模糊，肌節(jié)發(fā)生崩解；C1組樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，Z線和M線弱化，部分出現(xiàn)降解，A帶和I帶難以區(qū)分，肌節(jié)逐漸崩解；然而觀察圖6-D、圖6-E、圖6-F可以得出，用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)依然保持完整，Z線和M線出現(xiàn)輕微弱化，肌節(jié)部分紊亂，鄰近Z線的I帶減弱，這可能是由肌原纖維結(jié)合的鈣蛋白酶對肌肉纖維蛋白質(zhì)的水解作用造成的[37]。與對照組相比，用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理樣品在貯藏期間較好地保持了大菱鲆肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的完整性，表明這種復(fù)合涂膜很好地抑制了肌原纖維蛋白的降解，這可能是因為檸檬馬鞭草精油具有較強(qiáng)抗氧化性，能夠保護(hù)蛋白免于變性。

3 結(jié)論

本實驗研究了不同濃度的檸檬馬鞭草精油結(jié)合亞麻籽膠形成的復(fù)合涂膜對冰溫貯藏期間大菱鲆肌原纖維蛋白的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理魚樣能有效抑制蛋白質(zhì)氧化，包括延緩總巰基含量的減少和更好地保持Ca2+-ATPase活性。同時，復(fù)合涂膜處理抑制了α-螺旋的減少和內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，以及較低的游離氨基酸含量表明復(fù)合涂膜有效地抑制了蛋白質(zhì)降解。此外，通過透射電子顯微鏡觀察可得，復(fù)合涂膜處理的樣品在貯藏后期依然保持較完整的肌原纖維結(jié)構(gòu)。其中，以添加質(zhì)量濃度為0.128%檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜保鮮效果最佳。另外，精油作為植物的次級代謝產(chǎn)物，對于人類消費而言是安全的，因此，檸檬馬鞭草精油與亞麻籽膠結(jié)合是一種有效且具有應(yīng)用前景的保鮮大菱鲆的方法。