王一凡，劉永峰

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710062)

乳品是人們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常食用的食品，含有豐富的營養(yǎng)素。乳中的大量營養(yǎng)素包括蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪，微量營養(yǎng)素包括維生素和礦物質(zhì)。乳中還含有促進(jìn)人體健康的生物活性物質(zhì)，如表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、神經(jīng)生長因子、生長調(diào)節(jié)因子、環(huán)磷酸腺苷和免疫相關(guān)因子如免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等[1-2]。母乳是新生兒的首要營養(yǎng)物質(zhì)，其含有豐富且均衡的營養(yǎng)物質(zhì)，與嬰兒的生長發(fā)育密切相關(guān)。母乳可以通過免疫細(xì)胞和免疫分子，例如免疫球蛋白直接抵御病原體[3-5]；許多與免疫相關(guān)的物質(zhì)存在于母乳中，它們對嬰兒的影響已被廣泛認(rèn)可[6-7]。除了這些免疫成分外，母乳還含有一些非特異性因子，如溶菌酶(通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁抑制許多細(xì)菌的生長)、乳鐵蛋白(母乳中的一種多功能蛋白質(zhì)，它通過刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生來限制細(xì)菌的生長)和低聚糖(阻止微生物附著于嬰兒的黏膜，從而預(yù)防感染)，可以增強(qiáng)嬰兒的免疫功能[8]。

母乳及各種動物乳中還含有一些其他活性成分，可能對機(jī)體的健康有益，近期許多研究報(bào)道了母乳[9]、牛乳[10]、豬乳[11]和羊乳[12]中miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大量的乳中miRNA與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，超過60%的免疫相關(guān)前體miRNA(pre-miRNA)存在并富集于母乳中。通過對母乳源性miRNA的表達(dá)譜研究表明，這些miRNA可以促進(jìn)嬰兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育，并可能對兒童健康產(chǎn)生有益影響[14-15]。此外，牛乳miRNA可能在抗變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16-17]。本文對miRNA的合成和免疫功能以及miRNA在乳中分離提取和穩(wěn)定性進(jìn)行簡要概述，并分析了乳中miRNA作為潛在標(biāo)記物用于檢測乳品質(zhì)量，從而為乳中miRNA的研究提供新方向。

1 miRNA的合成及功能簡介

miRNA是真核生物中廣泛存在的一種長度大約為22 nt的非編碼RNA。miRNA通過調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化、繁殖、死亡等生理過程[18-20]。miRNA失調(diào)在疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，如癌癥和糖尿病[21-23]。miRNA主要通過結(jié)合靶基因的3’非編碼區(qū)誘導(dǎo)目標(biāo)靶mRNA降解或阻斷蛋白質(zhì)翻譯，是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的一種重要調(diào)控手段。具體合成miRNA的過程為：第一步，miRNA對應(yīng)基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄出初級miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA通常包含幾百個(gè)堿基對；第二步，微加工復(fù)合體切割pri-miRNA，同時(shí)在Drosha酶和Pasha酶的作用下加工形成約70 nt的“頸環(huán)前體”，即pre-miRNA；第三步，在細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5和Ran-GTP等作用下，細(xì)胞核中的pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，它們在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過Dicer酶的剪切和雙鏈RNA結(jié)合酶的作用進(jìn)一步加工成約22 nt的miRNA雙鏈。解鏈后，成熟的miRNA與RNA的誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，然后與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)揮miRNA的生物學(xué)功能，另一條序列則會立即被降解[24]。雖然miRNA研究時(shí)間較短，但已成為基因表達(dá)調(diào)控的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

2 乳中miRNA的分離提取與穩(wěn)定性研究

在血漿[25]、血清[25]、唾液[26]、尿液[27]和牛乳[28]中都報(bào)道發(fā)現(xiàn)了miRNA。乳中miRNA鑒定是乳品研究中的新興領(lǐng)域，對于乳質(zhì)量檢測和分析有著重要意義。目前一些研究集中在miRNA提供營養(yǎng)方面，miRNA參與很多生物過程，因此人們對miRNA作為牛乳生物活性成分的研究產(chǎn)生了興趣[29-32]。最近的研究發(fā)現(xiàn)包裹在外泌體和微泡中的miRNA可以作為細(xì)胞間信使，并在進(jìn)入其他細(xì)胞時(shí)影響細(xì)胞進(jìn)程[33-35]。

2.1 乳中miRNA的分離提取

miRNA可以從乳清(whey)、微泡(microvesicle)、外泌體(exosome)中分離提取出來，提取方法見表1。CHEN等[36]用有機(jī)法提取了初乳中miRNA；KOSAKA等[9]和IZUMI等[37]用離心柱法提取乳清中miRNA；SUN等[38]和HATA等[10]分別用超速離心法和有機(jī)法提取乳中微泡的miRNA；IZUMI等[39]使用有機(jī)法提取乳中外泌體的miRNA。HATA等[10]在牛初乳中提取的總RNA含量大約是成熟乳的1.7倍。

2.2 乳中miRNA的穩(wěn)定性研究

由于體液中同時(shí)存在RNA和RNase，miRNA的穩(wěn)定存在表明它們可以不被RNase消化[25]。將人工合成的RNA(包括miRNA和mRNA)加入牛乳中很快就會被降解，而牛乳本身的miRNA和mRNA卻可以在酸性條件及RNA酶處理后仍然保持穩(wěn)定[36]。母乳中miRNA經(jīng)RNase、反復(fù)凍融、低pH處理沒有發(fā)生明顯的變化，這表明miRNA可以抵抗嬰兒胃腸環(huán)境，進(jìn)而被小腸吸收，最終影響嬰兒的免疫系統(tǒng)[9]。母乳中存在外泌體和微泡，它們可以將miR-NA包裹在其膜內(nèi)從而不被降解[33,40]。外泌體和微泡具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)，通常由多種細(xì)胞分泌而來，其中包裹蛋白質(zhì)、RNA、miRNA等多種物質(zhì)，由于磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的存在從而保護(hù)miRNA不被降解。因此，由于miRNA特殊的穩(wěn)定性保證其在母乳中順利通過嬰兒胃腸道被小腸吸收。外泌體對miRNA在腸內(nèi)的轉(zhuǎn)移具有重要作用，可以防止細(xì)胞降解并促進(jìn)內(nèi)吞作用[41-42]。CHEN等[36]發(fā)現(xiàn)miRNA不僅存在于牛乳中，在液態(tài)乳制品、乳粉中也存在miRNA，說明這些miRNA穩(wěn)定存在于牛乳及牛乳制品中。牛、羊乳被廣泛應(yīng)用于乳品行業(yè)，而大多數(shù)的嬰兒乳粉以牛乳蛋白為基礎(chǔ)，有研究顯示，在商業(yè)巴氏殺菌乳制品中的miRNA可被成年人吸收[43]。此外，有研究表明牛乳外泌體包裹的miRNA可以進(jìn)入結(jié)腸癌細(xì)胞[41]、腸細(xì)胞[41]、腎細(xì)胞[43]、巨噬細(xì)胞[44]、以及人外周血單核細(xì)胞[43]。

3 乳中miRNA的免疫功能研究

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在調(diào)控重要生物過程的基因表達(dá)中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞增殖和分化、組織發(fā)育和免疫反應(yīng)[5,9,29]。miRNA有助于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)[5]。最近有研究表明，細(xì)胞外的miRNA通過包裹在外泌體或微泡中，穩(wěn)定地存在于體液中，可能在免疫應(yīng)答過程或在細(xì)胞間信息交流中扮演重要角色[9,27,45]。許多miRNA參與各種免疫相關(guān)的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，miRNA可以調(diào)控免疫細(xì)胞的各個(gè)方面，如發(fā)育、增殖、成熟、存活、穩(wěn)態(tài)、分化、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞因子表達(dá)[45]。例如在T細(xì)胞中，miR-181a調(diào)節(jié)細(xì)胞敏感性和增殖；miR-155調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答；miR-146a通過NF-kB信號激活T細(xì)胞受體。

在不同的泌乳階段，乳中miRNA表達(dá)量不同。與成熟乳相比，牛初乳中的miRNA具有更高的表達(dá)[36,38,44]。初乳的外泌體和微泡中所含免疫相關(guān)的miRNA含量高于成熟乳，并且這些miRNA可以進(jìn)入受體細(xì)胞中影響基因表達(dá)；初乳中富含抗體、溶菌酶、白細(xì)胞、寡糖等成分都具有免疫功能[38]?？梢?，泌乳早期的乳中含有更高含量的miRNA，可以在提供免疫保護(hù)方面發(fā)揮作用。

3.1 母乳miRNA免疫功能

2010年KOSAKA等[9]首次發(fā)現(xiàn)母乳中含有miRNA，且哺乳期前6個(gè)月乳中與免疫相關(guān)的miRNA含量較高，隨后其含量隨著時(shí)間的推移而逐步下降。與其他體液相比，母乳中含有大量的總RNA，母乳中高含量miRNA已被認(rèn)為與免疫相關(guān)[9,27,45]。免疫相關(guān)的miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-17-92、miR-125b、miR-146b、miR-223 和let-7i，在母乳乳清中廣泛存在[9]；免疫相關(guān)的miR-148a-3p、miR-30b-5p、miR-182-5p、miR-200a-3p、miR-29a-3p、miR-141-3p、miR-146b-5p、let-7f-1-5p、let-7f-2-5p、let-7a-2-5p和let-7a-3-5p在母乳外泌體中廣泛存在[13]；miRNA不僅在母乳的乳清和外泌體中存在，也在母乳的脂質(zhì)中廣泛存在，與免疫相關(guān)的miRNA有hsa-miR-148a、hsa-let-7a、hsa-miR-200c、hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-30d、hsa-let-7b和hsa-miR-21[46]。

3.2 牛乳miRNA免疫功能

牛乳一直以來都是人類廣泛食用的乳制品，也用于制造嬰兒配方乳粉。在牛乳中發(fā)現(xiàn)的miRNA其中大部分是與免疫相關(guān)的。IZUMI等[44]在牛乳清中發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的miRNA，包括miR-15b、miR-27b、miR-106b、miR-155、miR-223、miR-34a、miR-130a等。在牛乳微泡中發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的miRNA，包括miR-24、miR-30d、miR-93、miR-106a、miR-181a、miR-200a、miR-451、miR-223等[47-53]。

3.3 豬乳miRNA免疫功能

GU等[11]在豬乳外泌體中發(fā)現(xiàn)了12種豬特異的且含量豐富的miRNA，分別是miR-148a-3p、miR-182-5p、miR-200c-3p、miR-30d-5p、miR-574-3p、let-7a-1-5p、miR-30c-2-5p、miR-30c-1-5p、miR-191-5p、miR-375-3p、miR-27b-3p和miR-21-5p，這些miRNA被證明具有免疫功能。

4 乳中miRNA作為質(zhì)量控制指標(biāo)的分析

近年來，乳制品安全事件頻繁出現(xiàn)，許多不法商販通過向牛乳中摻水牟取不正當(dāng)利益。由于向牛乳中加水會導(dǎo)致除水以外的各項(xiàng)指標(biāo)降低，因此，為了提高各項(xiàng)檢測指標(biāo)，不法商販在牛乳中添加水后又向其中加入各種添加劑，并通過反復(fù)勾兌來使牛乳達(dá)標(biāo)。最常用的添加劑有以下幾種：蛋白(提高蛋白指數(shù))、乳清粉(提高各項(xiàng)指數(shù))、糊精、脂肪油(提高脂肪指數(shù))、二合一(可提高相應(yīng)各項(xiàng)指數(shù)，對蛋白指數(shù)最有效)[54]。其中，“二合一”的典型案例是三鹿乳粉事件中不法商販向牛乳中加水后又加入三聚氰胺。

現(xiàn)有的檢測牛乳質(zhì)量的方法主要是檢測蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等標(biāo)志物。雖然這些標(biāo)志物易于制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但都容易被人為操縱，因而難以實(shí)現(xiàn)牛乳質(zhì)量的檢測。最根本的牛乳質(zhì)量檢測方法是應(yīng)找到一種在牛乳中穩(wěn)定存在，而稀釋后該成分會變化，但不受添加劑影響的物質(zhì)。DNA分子以其高穩(wěn)定性逐漸成為食品品種鑒定的目標(biāo)分析物，基于DNA運(yùn)用PCR技術(shù)檢測不同動物乳的摻假[55-56]。早在2014年，劉永峰等[57]建立了從牛乳中提取大片段DNA(>1000 bp)的方法，并在后續(xù)的研究中優(yōu)化和擴(kuò)展了DNA的提取方法[58-60]，基于這些方法提取乳粉中的DNA用于檢測乳粉摻假，通過PCR擴(kuò)增，最低檢測到牛乳粉中摻假0.1%的羊乳粉[61]。DNA可以用于乳品質(zhì)量安全研究，同樣作為核酸的RNA也有相應(yīng)研究結(jié)果。張辰宇等[54]發(fā)現(xiàn)miRNA存在于原乳、商品液態(tài)乳制品及乳粉中，牛乳中的特異性miRNA圖譜不受任何添加劑的影響，并且與其他動物中miRNA圖譜不同。牛乳中特異性miRNA圖譜是一種用于檢測牛乳質(zhì)量的完美標(biāo)志物。因此，通過檢測這些miRNA中的任意一種或幾種就可以確定原乳的質(zhì)量，從而杜絕不法分子向牛乳中摻入其他物質(zhì)的可能。

CHEN等[36]研究表明，通過檢測乳制品中的蛋白質(zhì)或氮含量，已經(jīng)不能真實(shí)地反映乳品質(zhì)，但通過檢測特定的miRNA含量能準(zhǔn)確地反映乳品質(zhì)，評估正常乳和摻假乳之間的miRNA水平，比檢測蛋白質(zhì)或氮含量更可靠[36]。因此，評估正常牛乳和摻假牛乳的miRNA水平比其他標(biāo)記物，如蛋白質(zhì)、氮等，提供了更好的牛乳質(zhì)量控制選擇。

張辰宇等[62]通過檢測乳制品中的miRNA進(jìn)而鑒別乳制品，研究發(fā)現(xiàn)，若所測得的miRNA種類及含量與初乳樣品的miRNA表達(dá)譜相近或相同，則鑒定此樣品為初乳制品；若所測得的miRNA種類及其含量與成熟乳樣品的miRNA表達(dá)譜相近或相同，則鑒定為此樣品為成熟乳制品。因此，牛乳中所含miRNA可以作為潛在的牛乳質(zhì)量標(biāo)記物，將很有可能給整個(gè)乳制品行業(yè)，尤其是牛乳質(zhì)量控制領(lǐng)域帶來一場革命。

5 展望

在相關(guān)科學(xué)研究中，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況選擇最優(yōu)的乳中miRNA提取方法。乳中外泌體和微泡中包裹miRNA在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制還有待于深入探索。母乳中miRNA具有免疫功能，通過哺乳傳遞給嬰兒，現(xiàn)有的嬰幼兒配方乳粉中未考慮將miRNA作為營養(yǎng)素進(jìn)行添加，期望通過未來對乳中miRNA的深入研究可以闡明各種miRNA對機(jī)體的作用機(jī)制，從而有利于研制出適用于不同嬰幼兒的含miRNA的配方乳粉或輔助食品。