潘婷婷，張娟

（中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 211198）

目前已知的許多罕見病，如血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等，都是由特定基因的缺陷導(dǎo)致的。基因療法將治療核酸遞送至靶細(xì)胞，可以糾正致病的基因缺陷，持續(xù)表達(dá)治療性蛋白或沉默有害突變，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效治療的目的。重組腺相關(guān)病毒載體（Recombinant Adeno-Associated Viral Vector，rAAV）因其基因毒性低，可在多種組織中高效長(zhǎng)期表達(dá)蛋白以及低免疫原性等特性，正逐漸成為基因治療的主要載體。目前，已有3種基于AAV的基因療法分別在歐盟和美國(guó)獲批上市，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的報(bào)告預(yù)計(jì)每年將有10～20種新的細(xì)胞治療或基因治療產(chǎn)品上市。

對(duì)腺相關(guān)病毒（AAV）基因組結(jié)構(gòu)、病毒組裝以及生活周期的深入了解，使得其作為基因療法載體成為可能。AAV為直徑約26 nm的二十面體單鏈DNA病毒，基因組大小約為4.7 kb，共編碼Cap、Rep和aap 3種基因，基因兩端為反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeats，ITRs）。作為基因療法載體的rAAV刪除了所有病毒蛋白的基因，只保留與病毒復(fù)制和包裝相關(guān)的末端ITR序列，并在ITR之間插入治療性轉(zhuǎn)基因及必要的表達(dá)調(diào)控元件，病毒蛋白則以反式作用因子的形式提供。刪除病毒蛋白基因不僅可將AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量最大化，還可以減小免疫原性和細(xì)胞毒性。由于rAAV載體不表達(dá)Rep蛋白，其整合至宿主基因組的能力大幅減弱，從而降低了插入突變引起的基因毒性。rAAV基因組可在細(xì)胞核內(nèi)形成長(zhǎng)期存在的環(huán)狀串聯(lián)體，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。低免疫原性、低基因毒性、衣殼蛋白多樣、作用時(shí)間長(zhǎng)以及易于生產(chǎn)等特性使得AAV非常適合作為基因療法的載體。

雖然目前AAV載體在臨床上取得了初步的成功，但有關(guān)AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及宿主對(duì)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的擔(dān)憂使得研究者們?nèi)孕璨粩喔脑旌蛢?yōu)化AAV載體結(jié)構(gòu)、衣殼蛋白以及大規(guī)模生產(chǎn)工藝，以提高AAV對(duì)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、拓寬靶細(xì)胞范圍、避開宿主免疫反應(yīng)以及提高臨床可及性。本文將對(duì)AAV載體和衣殼蛋白工程改造的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理。

1 重組腺相關(guān)病毒載體設(shè)計(jì)及優(yōu)化

設(shè)計(jì)AAV載體時(shí)首先需要考慮的是AAV的包裝能力。當(dāng)AAV基因組小于5 kb時(shí)，病毒的包裝效率較高[1]。然而，許多治療性蛋白以及基因編輯核酸酶的編碼序列長(zhǎng)度都遠(yuǎn)大于5 kb以至于無(wú)法有效地包裝進(jìn)rAAV病毒顆粒中。針對(duì)這類情況，除了采用該蛋白的活性截短體外[2]，還可以利用AAV基因組能通過ITR序列或重疊序列之間的同源重組連接成多聯(lián)體的特性，將長(zhǎng)基因片段分別包裝于兩個(gè)或多個(gè)AAV載體中以擴(kuò)大AAV載體能遞送的片段長(zhǎng)度。有研究將耳畸蛋白5'部分和3'部分的cDNA編碼序列分別插入兩個(gè)含有重組橋接序列的AAV載體中，并在5'-和3'-cDNA后分別引入剪接供體和受體位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)6 kb的外源基因的遞送[3]。這些雙AAV載體的包裝序列有部分重疊，可在細(xì)胞內(nèi)通過分子間重組連接多個(gè)AAV載體，然后利用重組序列兩側(cè)的剪切信號(hào)來(lái)精確切除前mRNA中的重組序列，從而得到完整的轉(zhuǎn)基因片段[4]。還有的研究利用了內(nèi)含肽（Intein）介導(dǎo)的蛋白反式剪接（Protein transsplicing）將多個(gè)AAV載體表達(dá)的目的蛋白片段精確連接為全長(zhǎng)蛋白[5]。

AAV載體完整的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，形成內(nèi)涵體，胞漿運(yùn)輸，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核/蛋白酶體介導(dǎo)的降解，病毒脫殼，單鏈DNA復(fù)制為具有轉(zhuǎn)錄活性的雙鏈DNA，通過ITR序列重組形成可在細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)期存在的環(huán)狀外泌體DNA。因此，除了AAV包裝容量外，AAV衣殼蛋白的嗜性、細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的效率以及轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA的效率等，均會(huì)影響AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及目的基因的表達(dá)。其中，雙鏈DNA的合成是目的基因表達(dá)的限速步驟。有學(xué)者通過突變AAV基因組DNA一端的ITR序列使其成為可自身互補(bǔ)的雙鏈AAV載體（Self-complementary AAV，scAAV），從而避免了雙鏈DNA合成步驟對(duì)目的基因表達(dá)的影響，然而AAV載體的包裝容量會(huì)減少至3.3 kb左右[6]。

AAV表達(dá)載體中不同順式作用元件的組合可滿足不同的治療需求。例如，選擇合適的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子來(lái)提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平、實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)等。在多數(shù)情況下，rAAV基因表達(dá)盒會(huì)使用高轉(zhuǎn)錄活性的組成型啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因的高表達(dá)；表達(dá)RNA分子時(shí)通常會(huì)使用人或鼠的U6小核RNA啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)短發(fā)夾RNA和單鏈向?qū)NA的表達(dá)，以達(dá)到基因沉默或基因編輯的目的。其他調(diào)控元件，如內(nèi)含子和土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element，WPRE）等，可改善mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)基因表達(dá)[7-8]。由于AAV載體包裝能力的限制，載體所使用的順式作用元件需保持較小的尺寸。目前，有研究通過縮短肝特異性啟動(dòng)子的長(zhǎng)度以及結(jié)合不同增強(qiáng)子的方法，生成了42種小尺寸的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，在實(shí)現(xiàn)有效包裝的同時(shí)也提高了組織特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[9]。近年來(lái)，有學(xué)者使用計(jì)算機(jī)模擬的方法在全基因組規(guī)模上篩選出了長(zhǎng)度在41～551 bp，包含進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基序簇的14種肝細(xì)胞特異的順式作用調(diào)節(jié)模塊，有助于采用模塊化組裝的策略合理設(shè)計(jì)肝特異性啟動(dòng)子[10]。

天然的蛋白基因序列未充分利用宿主細(xì)胞的最優(yōu)選密碼子來(lái)表達(dá)蛋白，或者轉(zhuǎn)基因序列GC含量過高，存在隱蔽的剪接位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及影響RNA穩(wěn)定性的基序等缺點(diǎn)，均會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。因此，用于rAAV基因治療的轉(zhuǎn)基因序列需依據(jù)靶細(xì)胞的類型進(jìn)行相應(yīng)的密碼子優(yōu)化，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平[11]。

近年來(lái)的研究表明，3'端非翻譯區(qū)序列（3'untranslated Regions，3'UTR）在結(jié)合miRNA、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和翻譯調(diào)控等過程中具有重要作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，在rAAV基因組的3'UTR中引入miRNA122a（在肝中特異性表達(dá)）結(jié)合位點(diǎn)，可降低轉(zhuǎn)基因在正常肝組織中的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)肝脫靶、減少全身給藥時(shí)的rAAV載體用量以及提高基因療法的特異性和療效[12]。上述策略還可用于減少機(jī)體對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在體內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)具有重要意義[13]。在3'UTR中引入miRNA142（抗原呈遞細(xì)胞中豐度較高）結(jié)合位點(diǎn)可顯著減少轉(zhuǎn)基因在抗原呈遞細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而避免因機(jī)體免疫系統(tǒng)清除表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的細(xì)胞，并導(dǎo)致基因療法療效降低[14]。

2 重組腺相關(guān)病毒衣殼開發(fā)和優(yōu)化

rAAV載體衣殼蛋白的特性對(duì)其細(xì)胞靶向性、相關(guān)的預(yù)存免疫反應(yīng)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等有重要影響，研究人員通過對(duì)衣殼蛋白的改造可賦予其新的功能特性。衣殼開發(fā)方法包括天然發(fā)現(xiàn)、合理設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化和計(jì)算機(jī)發(fā)現(xiàn)（in silico discovery）策略[15]。目前，臨床上使用的大多數(shù)AAV血清型都是天然來(lái)源的，如從人類肝臟組織中分離出的AAV9可以穿越血腦屏障，遞送基因至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。然而，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示40%～80%的人有針對(duì)人源AAV的中和抗體，這會(huì)阻礙AAV載體對(duì)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，從非人靈長(zhǎng)類以及其他脊椎動(dòng)物中分離出的新型AAV血清型，如AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.43等[16]，可以克服這一問題。然而，天然存在的AAV血清型并不能很好地適應(yīng)臨床需求，仍需進(jìn)一步改造和優(yōu)化。

基于對(duì)常用AAV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與功能、與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合以及轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的研究，人們可以通過理性設(shè)計(jì)的手段改良病毒載體衣殼，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性和效率。例如，有研究將AAV9中結(jié)合多糖受體的基序嵌合到AAV2中來(lái)增加AAV2與細(xì)胞的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[17]；還有學(xué)者利用小鼠體內(nèi)模型來(lái)篩選由隨機(jī)核苷酸序列插入到AAV2 VP1的588堿基處構(gòu)建的AAV展示肽文庫(kù)，從而獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且擁有特定組織特異性的病毒衣殼序列[18]。除了整合特定多肽序列外，有學(xué)者通過影響轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如將暴露在AAV衣殼表面的酪氨酸殘基突變，抑制其磷酸化和泛素化修飾，來(lái)減少AAV載體在蛋白酶體中的降解，從而將轉(zhuǎn)基因在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平提高了 30 倍[19]。

理性設(shè)計(jì)的方法也只能發(fā)現(xiàn)有限的AAV衣殼變體。使用定向進(jìn)化的手段，可以在不了解AAV載體作用機(jī)制的背景下，對(duì)不同策略構(gòu)建的AAV多肽庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模體外/體內(nèi)加壓篩選，從而富集有益的衣殼蛋白變體，是一種高效的發(fā)現(xiàn)全新AAV載體的方法。構(gòu)建多樣化的AAV衣殼文庫(kù)的方法主要有易錯(cuò)PCR，基因改組生成嵌合衣殼、特定位點(diǎn)插入隨機(jī)多肽片段、衣殼表面高變成環(huán)區(qū)域的隨機(jī)替換[20]。其他定向進(jìn)化技術(shù)還包括蛋白質(zhì)片段的靶向重組、理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化相結(jié)合、基于Cre重組的AAV定向進(jìn)化（Cre recombination-based AAV directed evolution，CREATE）以及體內(nèi)定向進(jìn)化技術(shù)，這些技術(shù)已被廣泛用于AAV載體的開發(fā)[21]。其中，CREATE技術(shù)可用于篩選出能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞且成功轉(zhuǎn)化為DNA雙鏈的AAV載體。CREATE技術(shù)通過將隨機(jī)肽段插入到AAV9衣殼的3倍突起部位和在polyA結(jié)構(gòu)中引入Cre重組可逆開關(guān)的方法生成AAV衣殼文庫(kù)。將AAV衣殼文庫(kù)注射能夠組織特異性表達(dá)Cre的小鼠后，成功鑒定了可以特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)CNS 的 AAV-PHP.B[22]。

AAV衣殼蛋白庫(kù)定向進(jìn)化的路徑尚未明確，通過體外/動(dòng)物體內(nèi)篩選出的病毒衣殼在人體內(nèi)是否有效仍無(wú)法預(yù)測(cè)，而計(jì)算機(jī)分析則可以幫助人們理解改良AAV載體的特征。近年來(lái)，隨著下一代測(cè)序、DNA條形碼標(biāo)記和人工智能學(xué)習(xí)等新技術(shù)手段的出現(xiàn)，如今研究者們可以系統(tǒng)地對(duì)Cap基因全部735個(gè)位點(diǎn)的突變體（約20萬(wàn)種）進(jìn)行研究，從而更好地指導(dǎo)衣殼蛋白改造工程，確定適合改造的高變區(qū)域，加速靶向性AAV載體的發(fā)現(xiàn)[23]。有研究運(yùn)用DNA條形碼標(biāo)記和高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)追蹤定向進(jìn)化過程中AAV衣殼進(jìn)化過程，從而幫助人們理解定向進(jìn)化的機(jī)制，加速改良rAAV載體的鑒定[24]。通過對(duì)已知衣殼序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析和統(tǒng)計(jì)建模，可以預(yù)測(cè)AAV的進(jìn)化中間體和祖先衣殼序列，發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白上高度多樣性和保守性區(qū)域，從而為衣殼蛋白的定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)提供參考[25]。

3 結(jié)語(yǔ)

體內(nèi)基因療法治療模式十分廣泛，包括蛋白替代療法、基因編輯、基因沉默等，需要設(shè)計(jì)出多樣化的rAAV載體滿足不同的臨床需求。盡管rAAV作為基因療法載體在臨床上已取得初步成功，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，如在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，靶向特性欠佳，大規(guī)模生產(chǎn)成本高以及缺少可靠的評(píng)估AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的動(dòng)物模型等。對(duì)rAAV載體序列和衣殼蛋白的改造，可以賦予rAAV載體細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平以及躲避宿主免疫反應(yīng)等特性。然而，盡管已在體外或動(dòng)物模型中開發(fā)多種AAV載體，但這些載體在人體內(nèi)是否有效仍無(wú)法預(yù)測(cè)，只能通過開展多項(xiàng)臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估這些載體的安全性和有效性，選出最佳的候選載體。目前，對(duì)于腺相關(guān)病毒的開發(fā)仍處于起步階段，大部分臨床試驗(yàn)采用的仍是天然來(lái)源的AAV載體，未來(lái)將會(huì)有更多工程化rAAV載體進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，也必將會(huì)有更多的新技術(shù)出現(xiàn)，如人源化小鼠和3D人類組織培養(yǎng)作為篩選和臨床前療效評(píng)估模型。基因療法的一大缺點(diǎn)是治療費(fèi)用高昂，其中一個(gè)主要原因就是rAAV大規(guī)模生產(chǎn)難度高，因此未來(lái)對(duì)于rAAV大規(guī)模生產(chǎn)工藝的開發(fā)將是重點(diǎn)方向之一。