邢常瑞，初晨露，張曉云，汪金燕，鞠興榮，袁 建*

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與發(fā)全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量發(fā)全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

稻谷是世界上最重要的糧食作物，2012年全球稻谷年產(chǎn)量超過7億 t[1]。在稻谷加工成精米的過程中，根據(jù)工藝不同，產(chǎn)生的米糠約占稻谷質(zhì)量5%～8%。新鮮的米糠氣味清淡，味道微苦微甜，我國大部分米糠都是作為優(yōu)質(zhì)的動物飼料直接使用。在日本、印度等國家，去脂米糠添加到莫米粉或者大米粉中用于制作一些傳統(tǒng)淀粉基食品，盡管米糠的添加對食品外觀和顏色有些影響，但是對食品質(zhì)構(gòu)影響不大；米糠中油脂、蛋白含量高的特點(diǎn)也用于生產(chǎn)米糠油、替代魚粉等。米糠成分復(fù)雜，對不同成分的深入研究和利用可以極大提高米糠的商業(yè)價值[2]。

米糠營養(yǎng)價值高，可以提供豐富的維生素、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸和大量的蛋白質(zhì)[3]。同時，營養(yǎng)學(xué)家對大米蛋白、玉米蛋白、蠶絲蛋白、方日葵蛋白等在內(nèi)的許多自然資源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)很多蛋白、水解物和多肽具有酪氨酸酶抑制、抗癌、抗氧化活性和金屬離子螯合活性[4-7]。

銅作為一種人體必需的微量元素，是多種氧化酶的組成成分[8]。Megas等[9]用胃蛋白酶和胰液素對方日葵蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)具有Cu2+螯合活性的肽，氨基酸分析發(fā)現(xiàn)其富含組氨酸和精氨酸，抗氧化活性與β-胡蘿卜素相當(dāng)。Perkins等[10]發(fā)現(xiàn)甘氨酸-L-組氨酸-L-賴氨酸三肽與銅結(jié)合后形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，可以增加肝癌細(xì)胞對銅的吸回，并且銅絡(luò)合物具有誘導(dǎo)血管生成的能力。多肽-金屬螯合物比單純的氨基酸-金屬元素螯合物具有更高的配合率、穩(wěn)定性及生理活性[11-12]。Kubglomsong等[13]通過分離米糠白蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)多個肽序列具有酪氨酸酶抑制和銅螯合活性，一些多肽具有高效的酪氨酸酶抑制作用和螯合銅的能力。目前對于大米蛋白源金屬螯合肽的研究和發(fā)現(xiàn)比較少，加強(qiáng)對大米蛋白酶解多肽與金屬元素的結(jié)合能力和特異性研究，有助于多種金屬元素肽的發(fā)現(xiàn)和提高大米蛋白的高值產(chǎn)品的開發(fā)價值。

本實(shí)驗(yàn)從大米球蛋白胃蛋白酶水解物中篩選、鑒定并人工合成兩條多肽（QGWSSSSE和YYGGEGSSSEQGY），研究其與金屬離子的螯合活性，并比較這兩條多肽與乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸和金屬硫蛋白螯合金屬離子的能力大小，為后續(xù)進(jìn)一步研究生理活性和酪氨酸酶抑制能力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷為2018年采集自淮發(fā)市淮發(fā)區(qū)粳稻品種“淮稻5號”。

醋酸鈉緩沖溶液（p H 6.0）、兒茶酚紫、CuSO4?5H2O、EDTA、檸檬酸、金屬硫蛋白（相對分子質(zhì)量約為6 500）；合成肽1（QGWSSSSE）和合成肽2（YYGGEGSSSEQGY）由江蘇申基生物科技有限公司合成，純度大于95%。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax?M5多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；7700x電感耦合等離子質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；TRIPLETOF 5600液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 大米中蛋白的提取和測定

稻谷用礱谷機(jī)將稻谷外殼去掉，保留糙米，然后用萬能粉碎機(jī)將糙米磨成粉末，過60 目篩得到糙米粉，進(jìn)行4 種蛋白的連續(xù)提取。

根據(jù)4 種蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）溶解度的差異，分別以蒸餾水、5% NaCl溶液、70%乙醇溶液、0.05 mol/L NaOH溶液作為主要溶劑，采用Osborne法分步提取4 種蛋白[14]。每次室溫攪拌提取時間2 h、固液比4∶1，10 000 r/min離心10 min分離沉淀蛋白，每步重復(fù)提取3 次，合并提取液通過0.45 μm濾膜過濾。通過滴加2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)等電點(diǎn)沉淀提取液中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行冷凍干燥，-20 ℃保存。對冷凍干燥的蛋白質(zhì)進(jìn)行ICP-MS測定，測定25 種元素含量[15]。

1.3.2 胃蛋白酶水解球蛋白

由于谷蛋白和醇溶蛋白的水溶解差，只有在堿性條件下才能溶解，故選擇球蛋白進(jìn)行酶解。將分離得到的1 g的大米球蛋白溶解于蒸餾水中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，調(diào)節(jié)反應(yīng)的溫度（37 ℃）和pH值（胃蛋白酶pH 2），攪拌溶解1 h后，加入胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。酶解4 h，監(jiān)測反應(yīng)pH值，通過1 mol/L的HCl溶液保持反應(yīng)pH值不變。

1.3.3 球蛋白酶解肽鑒定和人工合成

回集酶解液，使用超濾管進(jìn)行分離，超濾管截留分子質(zhì)量為3 kDa。通過超濾膜后的下層濾液，用50%乙腈溶液，稀釋10 倍，過0.22 μm的有機(jī)系微孔濾膜，通過SCIEX Triple-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析，選擇Agilent 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）作為分離柱，流速0.4 mL/min，柱溫37 ℃，上樣體積10 μL。質(zhì)譜離子源選擇正離子模式，干燥氣溫度200 ℃，干燥氣流速15 L/min，鞘氣溫度370 ℃，鞘氣流速12 L/min，碰撞電壓380 V，質(zhì)譜掃描范圍m/z100～2 000，梯度洗脫條件見表1。

表1 測定球蛋白水解多肽梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for separation of rice globulin peptides

獲得的測試數(shù)據(jù)通過PEAKS軟件鑒定球蛋白酶解多肽的種類，對比數(shù)據(jù)庫中的球蛋白氨基酸序列，并分析其可能的金屬元素螯合能力，并進(jìn)行人工合成。

1.3.4 大米多肽和不同參照物Cu2+金屬離子螯合活性的測定

對比文獻(xiàn)[13]和分析氨基酸組成，選擇2 條可能具有螯合元素活性的大米多肽（記為合成肽1和合成肽2），根據(jù)Carrasco-Castilla等[16]的方法測定其與Cu2+金屬離子螯合活性。同時測定參照物EDTA、檸檬酸、金屬硫蛋白和Cu2+金屬離子螯合活性，并比較螯合能力的大小。

1.3.4.1 大米多肽與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

用pH 6.0醋酸鈉緩沖溶液配制多肽溶液，合成肽1的溶液濃度梯度為0～68.48 mmol/L，合成肽2的濃度梯度為0～38.76 mmol/L。取20 μL大米多肽溶液與270 μL的50 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液和6 μL的4 mmol/L兒茶酚紫溶液以及10 μL的4 mmol/L CuSO4?5H2O溶液混合，混勻靜置反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀測量溶液在632 nm波長處的吸光度，按照下式計算銅螯合率：

1.3.4.2 EDTA、檸檬酸及金屬硫蛋白與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

取用pH 6.0醋酸鈉緩沖溶液配制的EDTA或檸檬酸溶液，EDTA和檸檬酸溶液濃度梯度為0～10.0 mmol/L，金屬硫蛋白溶液濃度梯度為0～2.08 mmol/L。取10 μL溶液與280 μL的50 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）和6 μL 4 mmol/L兒茶酚紫溶液以及10 μL的4 mmol/L CuSO4?5H2O溶液混合，混勻靜置反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀測量溶液在632 nm波長處的吸光度，計算銅螯合率。

1.3.5 大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+等金屬離子螯合活性的測定

先用醋酸鈉緩沖溶液配制20 mmol/L CdCl2、FeCl2和CaCl2等溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)過程，分別取上述不同濃度的大米多肽溶液（20 μL）、EDTA（10 μL）、檸檬酸（10 μL）和金屬硫蛋白溶液（10 μL），與10 μL 20 mmol/L CdCl2溶液混合均勻，室溫靜置反應(yīng)1 h。余下的實(shí)驗(yàn)步驟相同，測定大米多肽和參照物與Cd2+金屬離子螯合活性（以吸光度表示）。按照同樣的方法測定大米多肽和參照物與Fe2+和Ca2+金屬離子螯合活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白的提取和多元素含量分析

表2 糙米粉和大米蛋白中不同元素含量Table 2 Metal element contents in brown rice fl our and rice proteins mg/kg

糙米粉經(jīng)過石油醚攪拌脫脂后，根據(jù)蛋白溶解度的差異，采用分步提取4 種蛋白，冷凍干燥后進(jìn)行ICP-MS檢測，檢測與蛋白質(zhì)結(jié)合的多種優(yōu)勢元素。由表2可知，在4 種蛋白質(zhì)中都含有銅，范圍為3.238～26.125 mg/kg。因此，分析這大米4 種蛋白中的銅結(jié)合肽可行。Kubglomsong等[13]報道從大米清蛋白中發(fā)現(xiàn)多個肽序列具有銅螯合活性，特別是SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG肽序列，肽螯合銅的活性比EDTA螯合銅的能力要強(qiáng)，考慮到在實(shí)驗(yàn)中觀察到谷蛋白和醇溶蛋白的水溶解性差，在胃蛋白酶酶解過程中易產(chǎn)生沉淀，酶解不完全，本實(shí)驗(yàn)選取球蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 大米球蛋白胃蛋白酶水解多肽鑒定、分析和人工合成

對超濾后的多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過SCIEX Triple-TOF-MS分析m/z在100～2 000之間的目標(biāo)物，通過軟件分析肽的序列，匹配覆蓋率最高的蛋白是由Os05g0499100基因編碼的19 kDa globulin，品種來源是Oryza sativasubsp.japonica，整個蛋白的序列是MASKV VFFAAALMAAMVAISGAQLSESEMRFRDRQCQREVQ DSPLDACRQVLDRQLTGRERFQPMFRRPGALGLRMQC CQQLQDVSRECRCAAIRRMVRSYEESMPMPLEQGWS SSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEGSSEEGYYGEQQQQPG MTRVRLTRARQYAAQLPSMCRVEPQQCSIFAAGQY。氨基酸序列出峰時間在2～7 min之間，23 條肽的氨基酸序列、分子質(zhì)量、m/z和保留時間見表3。

表3 胃蛋白酶水解球蛋白多肽序列鑒定Table 3 Identification of globulin peptides derived from enzymatic hydrolysis with pepsin

能夠和元素結(jié)合的多肽已經(jīng)有許多報道。早在1973年發(fā)現(xiàn)GHK-Cu具有與Cu2+結(jié)合能力，多項(xiàng)研究表明GHK-Cu對健康非常有益，特別是在防止氧化應(yīng)激和退行性老化方面具有顯著的功能[17]。Wang Li等[18]報道發(fā)現(xiàn)Phe-Val-Asp-Val-Thr具有與Ca2+結(jié)合的能力。Kubglomsong等[13]發(fā)現(xiàn)多條具有與Cu2+結(jié)合活性的多肽，比如多肽序列QGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEG，SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG和金屬銅有較強(qiáng)的螯合活性。研究發(fā)現(xiàn)多個相鄰的絲氨酸（serine，S）在分離組分1多肽中占比較高，表明SS、SSS和SSSS可能與銅的結(jié)合活性和酶抑制能力相關(guān)[4,13,19]。Mandal等[20]報道了絲氨酸殘基可以通過羧基和氨基基團(tuán)上的氧原子和氮原子結(jié)合Cu2+，而含有多個絲氨酸的多肽正是通過結(jié)合酪氨酸酶中的Cu2+從而抑制其活性。盡管Kubglomsong等[13]已經(jīng)報道了大米蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后形成較長的多肽，并具有銅結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些多肽序列在經(jīng)過胃蛋白酶消化后，更傾方于形成較短的多肽，見表3。

基于之前多項(xiàng)研究結(jié)論，分析獲得的23 個多肽序列，合成肽1：QGWSSSSSE，M=993（包含表3中的肽序號2序列）和合成肽2：YYGGEGSSSEQGY，M=1 599.7（與表3中肽序號22序列相同）進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。原因是這兩個肽含有SSS和SSSSS連續(xù)的絲氨酸序列，同時這兩個序列是Kubglomsong等[13]報道的具有銅螯合活性序列（QGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEG）的前半部分和后半部分。其中合成肽2是SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG中間部分，具有銅螯合活性和酶抑制能力的可能性很大。

在確定選取這兩條多肽后，進(jìn)行人工合成，并通過質(zhì)譜進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見圖1。

圖1 人工合成的合成肽1（A）和合成肽2（B）檢測結(jié)果Fig. 1 Mass spectra of artificially synthesized QGWSSSSSE (A) and YYGGEGSSSEQGY (B)

2.3 大米多肽和不同參照物與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

EDTA是能與Cu2+、Cd2+、Fe2+、Pb2+等二價金屬離子結(jié)合的一種螯合劑，在很多核酸、酶和蛋白質(zhì)中作為輔基而發(fā)揮作用，因此EDTA可作為核酸酶、蛋白酶的抑制劑。在之前的研究中通過EDTA螯合金屬離子形成人工抗原制備重金屬的單克隆抗體，表明EDTA具有很強(qiáng)的Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cr3+和Cu2+螯合活性，能夠在免疫系統(tǒng)中穩(wěn)定存在并作為抗原位點(diǎn)刺激免疫系統(tǒng)[21-25]。檸檬酸對很多金屬離子也具有螯合作用，對于不同的金屬離子其螯合的能力也不一樣，已經(jīng)報道可以利用檸檬酸除去大米中的重金屬Cd2+而對Pb2+不是很理想[26]。Lerch[27]發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白在動植物元素轉(zhuǎn)運(yùn)和去毒方面具有重要作用，并且發(fā)現(xiàn)銅金屬硫蛋白與鎘金屬硫蛋白、鋅金屬硫蛋白具有類似的肽序列，表明蛋白中特定的肽序列具有元素結(jié)合的能力。因此，在測定大米多肽與Cu2+螯合活性過程中，選取了EDTA、檸檬酸和金屬硫蛋白作為能夠與銅螯合的小分子、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)的代表。

圖2 大米多肽和不同參照物與Cu2＋金屬離子螯合率Fig. 2 Copper-chelating activity of rice peptides and other chelating agents

從圖2可知，所測定物質(zhì)螯合銅能力大小排序?yàn)椋航饘倭虻鞍祝綞DTA＞檸檬酸＞合成肽2＞合成肽1。

IC20、IC50和IC80是某一藥物或者小分子抗原的濃度抑制某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，抑制效果可以達(dá)到相對于空白20%、50%和80%的濃度。包括生物化學(xué)反應(yīng)酶催化、抗原抗體反應(yīng)等[28]。IC20值越低，對底物或者生化反應(yīng)的抑制作用效果越好。通過計算IC20可知：EDTA的IC20為1.10 mmol/L，檸檬酸IC20為2.91 mmol/L，金屬硫蛋白IC20為0.28 mmol/L，人工合成肽1的IC20為10.78 mmol/L，人工合成肽2的IC20為5.40 mmol/L，人工合成肽2的螯合銅的效果好于人工合成肽1，原因可能是人工合成肽2的氨基酸數(shù)量更多，種類更豐富，與Cu2+結(jié)合形成的絡(luò)合物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[29]。人工合成肽2螯合Cu2+的效果在低濃度范圍內(nèi)更接近檸檬酸。

2.4 大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+金屬離子螯合活性的測定

為比較大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+的結(jié)合能力，用不同濃度的大米多肽溶液、EDTA、檸檬酸和金屬硫蛋白溶液跟含有20 mmol/L的Cd2+、Fe2+和Ca2+溶液混合均勻，室溫靜置反應(yīng)1 h，檢測結(jié)果見表4。

表4 EDTA與不同金屬離子的螯合活性Table 4 Chelating activity of EDTA toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

以EDTA為例，如果EDTA與Cd2+、Fe2+、Ca2+可以形成螯合物，結(jié)合穩(wěn)定性比與Cu2+螯合物的穩(wěn)定性相當(dāng)或者更高，則不會與Cu2+形成螯合物，從而不會影響兒茶紫酚與銅的復(fù)合物的數(shù)量，顯色保持不變。如果形成螯合物的結(jié)合穩(wěn)定性比與Cu2+螯合物的穩(wěn)定性差，那么在有Cu2+存在時會傾方于與Cu2+形成螯合物，隨著EDTA濃度增加，兒茶紫酚與銅的復(fù)合物數(shù)量降低，顯色水平降低。從表4可知，EDTA與Cd2+、Fe2+的結(jié)合能力與Cu2+相當(dāng)或者更強(qiáng)；而與Fe2+的結(jié)合能力比Cu2+差。結(jié)果與EDTA的螯合穩(wěn)定性常數(shù)一致（lgK（Cu-EDTA）=18.8，lgK（Fe-EDTA）=25.1，lgK（Cd-EDTA）=16.4，lgK（Ca-EDTA）=11.0）[30-31]。

表5 檸檬酸與不同金屬離子的螯合活性Table 5 Chelating activity of citric acid toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

表6 金屬硫蛋白與不同金屬離子的螯合活性Table 6 Chelating activity of metallothionein toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

從表5可知，Cd2+和Ca2+反應(yīng)液的吸光度隨檸檬酸濃度增加大幅度降低；而Fe2+的吸光度相比較之下幾乎不變。結(jié)果表明，在檸檬酸和Cd2+和Ca2+螯合后，再加入Cu2+，Cu2+會取代螯合位點(diǎn)的Cd2+和Ca2+，Cu2+與兒茶紫酚的復(fù)合物減少，吸光度降低。結(jié)果符合金屬離子與檸檬酸的螯合穩(wěn)定性順序：Cu2+＞Cd2+＞Ca2+，檸檬酸與Cu2+螯合后的穩(wěn)定性最好[32]。對于Fe2+，檸檬酸與之螯合后會形成黃色的沉淀，不容易再被Cu2+占據(jù)螯合位點(diǎn)，因此會使得溶液的吸光度幾乎不變。按照同樣的方法得知（表6），金屬硫蛋白的螯合金屬離子穩(wěn)定性的順序?yàn)椋篎e2+＞Cu2+＞Cd2+、Ca2+。

表7 合成肽1與不同金屬離子的螯合活性Table 7 Chelating activity of synthetic peptide 1 toward Cd2+, Fe2+, Ca2+ and Pb2+

表8 合成肽2與不同金屬離子的螯合活性Table 8 Chelating activity of synthetic peptide 2 toward Cd2+, Fe2+, Ca2+ and Pb2+

合成肽1和合成肽2與其他元素的結(jié)合效果見表7、8。合成肽1和合成肽2與Cd2+、Ca2+、Pb2+的螯合吸光度變化趨勢和大米多肽與Cu2+的螯合活性變化幾乎呈現(xiàn)相同的趨勢，表明Cd2+、Ca2+、Pb2+與合成肽的螯合物穩(wěn)定性沒有Cu2+強(qiáng)；而Fe2+混合液的吸光度幾乎不變，說明Fe2+螯合大米多肽的穩(wěn)定性比Cu2+要好。因此，合成肽1和合成肽2形成穩(wěn)定的復(fù)合物的順序是Fe2+＞Cu2+＞Cd2+、Ca2+、Pb2+。

3 結(jié) 論

大米蛋白可以與多種元素結(jié)合，是稻谷富集元素的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)通過胃蛋白酶酶解大米球蛋白，篩選到兩種大米蛋白源金屬結(jié)合肽。其中，合成肽2在低濃度范圍的螯合能力與檸檬酸相當(dāng)，比合成肽1效果好。這兩種金屬結(jié)合肽與Cu2+螯合能力比EDTA和金屬硫蛋白弱很多。在螯合選擇性方面，合成肽1和合成肽2都具有較強(qiáng)的Cu2+和Fe2+螯合活性，而與Cd2+、Ca2+和Pb2+金屬離子幾乎不結(jié)合。