張 超，李俊薇，劉占奇，孫 琳，董孝元，李 瑞

（1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430050；2.武漢雅仕博科技有限公司，湖北武漢 430050）

白酒中的有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)白酒口味使酒體醇和爽口，不同的有機(jī)酸與醇在各種微生物酶的催化作用下生成不同的酯。其中己酸乙酯作為濃香型白酒的主體香是判定濃香型白酒質(zhì)量等級(jí)的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。濃香型白酒采用全泥窖發(fā)酵模式，因而窖泥的質(zhì)量也就成為影響濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，而窖泥中微生物的種類(lèi)與數(shù)量又決定著窖泥的質(zhì)量，環(huán)環(huán)相扣密不可分[2]。窖泥中的微生物以細(xì)菌為主，尤其以芽孢桿菌為多，生長(zhǎng)繁殖需嚴(yán)格厭氧環(huán)境且生長(zhǎng)速度緩慢[3]?，F(xiàn)階段借助于一代測(cè)序技術(shù)，可以從16S rDNA序列分析入手對(duì)微生物進(jìn)行種屬的鑒定，對(duì)微生物的研究更加深入。因此，開(kāi)展對(duì)產(chǎn)己酸微生物的選育、培養(yǎng)及應(yīng)用研究，對(duì)于提高濃香型白酒質(zhì)量有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從黃鶴樓酒業(yè)濃香型白酒窖泥著手，篩選關(guān)鍵功能微生物，進(jìn)行單菌株發(fā)酵鑒定，并對(duì)發(fā)酵液的己酸等有機(jī)酸定量分析，為濃香型白酒生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：窖泥，樣本取自黃鶴樓酒業(yè)濃香窖池。

富集培養(yǎng)基（巴氏合成培養(yǎng)基）：醋酸鈉0.5%，硫酸鎂0.02 %，硫酸銨0.05 %，酵母浸粉0.1 %，磷酸氫二鉀0.04%，pH5.8～7.0,121 ℃滅菌20 min，接種前加入無(wú)水乙醇2%。

分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入瓊脂2 %，碳酸鈣2%。

儀器設(shè)備：DZF-6050B真空培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡EclipseE100；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；TC-96/GPCR擴(kuò)增儀；ChampGel5000凝膠成像儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng)[4]

樣品預(yù)處理：稱取1 g優(yōu)質(zhì)窖泥，加入裝有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，以180 r/min振蕩30 min后在80 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min以消除非芽孢菌體，在預(yù)熱過(guò)程中不斷晃動(dòng)三角瓶避免局部受熱[5]。冷卻至30～40 ℃，無(wú)菌條件下吸取1 mL樣品液于20 mL富集培養(yǎng)基，加入2 %（體積分?jǐn)?shù)）無(wú)水乙醇進(jìn)行試管培養(yǎng)，用500 μL液體石蠟封住培養(yǎng)基液面以隔絕外部空氣[6]，用膠塞封口，置于真空干燥箱中，抽真空0.08 MPa左右，充入N2以此循環(huán)2次，在34 ℃下恒溫培養(yǎng)10 d，觀察試管內(nèi)菌液產(chǎn)氣情況。

1.2.2 分離純化

將富集培養(yǎng)后的菌液再進(jìn)行80 ℃水浴熱處理10 min。在無(wú)菌室中用無(wú)菌吸管吸取菌液1 mL，放入盛有9 mL無(wú)菌水的吸管中，依次稀釋到10-3，取10-1、10-2、10-33個(gè)稀釋度的稀釋液與50 ℃分離培養(yǎng)基混合倒板、搖勻，34 ℃培養(yǎng)3～5 d。

將不同形態(tài)的單菌落分別接種于20 mL巴氏液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，觀察產(chǎn)氣情況以及對(duì)培養(yǎng)液定性分析確定有己酸。反復(fù)進(jìn)行3次單菌純化工作，確認(rèn)為純種后可進(jìn)行保藏[7]。

1.2.3 定性鑒定及鏡檢

吸取2 mL混合均勻的己酸培養(yǎng)液，加入2%硫酸銅溶液2 mL，然后再加1 mL乙醚后充分振蕩混合均勻，靜置分層后觀察乙醚層顏色。如果乙醚層呈藍(lán)綠色，則證明菌液中含有己酸，且顏色越深己酸含量越高[8]。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

DNA提取[9]：使用上海生工單菌株基因組試劑盒提取DNA。

PCR擴(kuò)增[10-11]：采用引物27F/1492R對(duì)Z-1進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。

引物序列：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')。

1492R：(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dH2O 3.5 μL；Primer（2 μM）5 μL，2× Direct PCR Mix 10 μL；基因組DNA 1 μL；Taq酶0.5 μL。

PCR擴(kuò)增條件：

取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠（120 V，25 min）電泳，使用Marker DL2000。

1.2.5 己酸測(cè)定

1.2.5.1 定性分析

方法同1.2.3。

1.2.5.2 定量分析[12]

GC檢測(cè)條件：檢測(cè)器：氫離子火焰檢測(cè)器；色譜柱：DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

溫度程序：50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃保持2 min；檢測(cè)器溫度230 ℃；載氣He，流速1 mL/min。

液體樣品處理：吸取3 mL發(fā)酵液樣品在10000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，通過(guò)濾膜過(guò)濾后吸取1 mL濾液到含有100 μL 2-乙基丁酸（1.010 g/L）的10 mL容量瓶中，并用體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸定容至刻度，混合均勻后吸取1 μL進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)己酸菌分離結(jié)果

通過(guò)多次分離純化，共分離得到2株產(chǎn)己酸菌，分別記為Z-1、Z-2，菌株特征見(jiàn)表1和圖1所示，均為革蘭氏陽(yáng)性微生物；兩株微生物的定性顯色反應(yīng)如圖2所示；從圖1可以看出，菌株Z-1產(chǎn)己酸量高于Z-2，在試驗(yàn)中優(yōu)選Z-1做理想菌株保存。

表1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

圖1 鏡檢圖(10×100）

圖2 定性顯色圖

2.2 菌種分子生物學(xué)鑒定

提取菌株Z-1基因組DNA，然后以基因組DNA為模板對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，為單一條帶、明亮條帶，1.4 kb左右。

圖3 菌種基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖

將菌株Z-1的16S rDNA（1464bp）序列輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的已知分類(lèi)菌株序列進(jìn)行比較，菌株Z-1與Aneurinibacillus migulanus同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株Z-1為Aneurinibacillus migulanus[13]，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 己酸測(cè)定分析

2.3.1 定性測(cè)定

微生物產(chǎn)己酸定性顯色反應(yīng)結(jié)果如圖4，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接后Z-1顯色效果良好。

2.3.2 定量測(cè)定（圖5）

從圖5可以得出，利用氣相色譜法可以一次性測(cè)出發(fā)酵液中的己酸、丁酸等有機(jī)酸含量。Z-1發(fā)酵液樣品中檢測(cè)出己酸含量為3.5 g/L，丁酸含量1.12 g/L。

表2 Z-1測(cè)序結(jié)果

圖4 定性顯色圖

圖5 Z-1發(fā)酵液色譜圖

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃鶴樓酒業(yè)濃香型白酒窖泥進(jìn)行微生物分離純化，鑒定出1株高產(chǎn)己酸的硫胺素芽孢桿菌，并利用氣相色譜對(duì)單菌株發(fā)酵液進(jìn)行己酸定量測(cè)定，其產(chǎn)己酸量達(dá)3.5 g/L。

但關(guān)于硫胺素芽孢桿菌[14-15]的生長(zhǎng)規(guī)律方面還有待進(jìn)一步研究，根據(jù)菌株的生長(zhǎng)規(guī)律可有針對(duì)性的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。在后期應(yīng)用于窖池養(yǎng)護(hù)與窖泥制作過(guò)程中，要注意其生長(zhǎng)階段的選取，這樣可以有效縮短發(fā)酵期。