范 鏖，楊 濤

（中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041）

中國白酒是傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，自然發(fā)酵、多微共酵的傳統(tǒng)工藝使微生物菌群和發(fā)酵過程都較為復(fù)雜。研究功能性成分、特征風(fēng)味成分及其形成的代謝機制，了解主要功能微生物的代謝規(guī)律及關(guān)鍵微生物相互作用機制，進而定向選育功能微生物、開發(fā)新型復(fù)合微生物菌劑實現(xiàn)自動化、智能化生產(chǎn)，使傳統(tǒng)釀造由經(jīng)驗型向現(xiàn)代化、科學(xué)化轉(zhuǎn)變，這是傳統(tǒng)釀造食品發(fā)展的必然趨勢，而這些研究都需建立在釀造微生物菌株的獲得及其功能解析的基礎(chǔ)上，因而釀造功能微生物菌種資源的篩選與應(yīng)用是傳統(tǒng)釀造食品升級改造的基礎(chǔ)和核心。

中國科學(xué)院成都生物研究所從20世紀70年代末期就非常重視白酒釀造微生物菌種資源的分離收集，吳衍庸[1]老師在己酸菌、產(chǎn)甲烷菌及放線菌方面進行了開創(chuàng)性的研究，名酒組其他老師在酵母菌、根霉、紅曲霉、芽孢桿菌等方面也開展了許多篩選與應(yīng)用研究。在以傳統(tǒng)微生物分離方法基礎(chǔ)上，對于一些難培養(yǎng)、生長慢或者營養(yǎng)要求比較特殊的菌株，研究采用基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)解析傳統(tǒng)釀造食品微生物多態(tài)性和優(yōu)勢微生物演變規(guī)律，建立關(guān)鍵菌株可培養(yǎng)分離技術(shù)、特色菌株篩選模型。幾十年的積累，從傳統(tǒng)白酒釀造物料（曲藥、糟醅、窖泥等）分離篩選了濃香、醬香、清香等不同香型的曲藥、糟醅、窖泥等微生物菌種資源。系統(tǒng)分離保藏了清香、濃香、醬香等不同香型關(guān)鍵工序釀造功能微生物菌種約900株?；谶@些菌種資源構(gòu)建的窖泥功能菌劑、嗜熱芽孢桿菌菌劑、麩曲醬香功能菌劑及芝麻香功能菌劑在多個企業(yè)應(yīng)用取得了顯著的效果。

在建設(shè)和維護菌種庫的同時，我們進一步研究菌種功能評價技術(shù)體系，針對白酒行業(yè)技術(shù)進步和市場變化的趨勢，組合出不同功能的功能菌菌劑，希望能更加充分地發(fā)揮菌種庫的作用。本文即是菌種庫功能菌評價方法的建立，以及應(yīng)用這種方法，研發(fā)白酒“綿柔因子”生成菌劑的報告。

在實驗室建立以五糧為原料，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎(chǔ)系統(tǒng)，再向其中添加菌種庫中不同功能菌的純種或組合菌劑，以產(chǎn)酒的理化指標(biāo)和嘗評結(jié)果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：霉菌(白曲霉Z#、黃曲霉Q#)；酵母菌(產(chǎn)酒酵母L#、產(chǎn)香酵母L1#)。

曲樣：大曲，取自正常生產(chǎn)大型酒企；小曲，外購安琪甜酒曲。

原料：取自正常生產(chǎn)大型酒企的大米、高粱、玉米（粉碎）、糯米、小麥。

1.2 實驗方法

1.2.1 使用米曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

1.2.1.1 制作米曲（白曲米曲和黃曲米曲方法一致）

把大米洗3遍，加水至浸沒大米5 cm處浸泡45 min，然后瀝干0.5 h，蒸煮45 min，攤冷至30 ℃左右，得到水分為30 %～35 %的蒸米，分裝于淺盤，無菌條件下接入菌種孢子懸液（孢子數(shù)1×105個/g大米），置于相對濕度95 %、28～30 ℃培養(yǎng)箱中堆積培養(yǎng)。16～20 h期間，溫度上升至44～48 ℃時，攤開混合、降溫后再堆積1次；溫度上升至40～44 ℃再次攤開混合，控制溫度36～40 ℃；至36 h時再翻動1次，控制溫度32～36 ℃；至40 h時，除去濕度，32～34 ℃通風(fēng)干燥培養(yǎng)至總時間為44～46 h，可直接出曲使用。

也可在40～45 ℃烘干1 d，最后水分含量為16%左右，低溫保藏備用。優(yōu)質(zhì)曲為物料表面及內(nèi)部長滿白色菌絲，無或少見孢子著生，無雜色，口嚼酸甜味明顯。

1.2.1.2 酒母的制作

米曲汁培養(yǎng)基調(diào)至Brx 10%，取適量放入三角瓶中，121 ℃、15 min濕熱滅菌并冷卻后，分別挑取L#和L1#菌株2%YPD培養(yǎng)基上的新鮮酵母菌苔1環(huán)接入，25 ℃恒溫條件下，靜置培養(yǎng)2 d。即可得到產(chǎn)酒酵母L#和產(chǎn)香酵母L1#的酵母菌培養(yǎng)液。

1.2.1.3 種子培養(yǎng)

發(fā)酵用曲量以33 %作為基準(zhǔn)，稱取所需米曲165 g放入500 mL三角瓶中，按米曲的120 %添加量加入200 mL水，再加入酒母至細胞濃度106cell/mL（其中，產(chǎn)酒酵母L#∶產(chǎn)香酵母L1#=2∶1），混合均勻后，25 ℃靜置培養(yǎng)3～6 d。

1.2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.1.4.1 原料的浸泡和蒸煮

大米：將大米稱量后用自來水清洗1～2次，加入2～3倍大米質(zhì)量的水于常溫下浸泡15～16 h，過濾后于常壓蒸煮器中進行蒸煮。上氣后蒸煮時間為30～40 min，中間每10 min淋水翻拌1次，以米粒熟透、不黏手為準(zhǔn)。

高粱：稱量后用自來水清洗1～2次，冷水條件下浸泡1 d，再蒸煮2 h。蒸煮過程中淋水2～3次。

玉米：將粉碎后的玉米渣先在常溫下浸泡12 h，后加溫至65 ℃，保溫4～5 h。換水，在常溫下再浸泡12 h。經(jīng)反復(fù)浸泡，冷熱交替處理，讓緊密的玉米淀粉吸水膨脹，吸收足夠的水分，易于蒸煮。蒸煮時將玉米糝放入鍋內(nèi)，當(dāng)加熱至蒸汽冒出后，加蓋蒸2 h，方便原料蒸透，中途淋水2～3次，每次要淋透。

糯米：糯米除雜，洗凈，保持水面浸沒糯米上層10 cm，常溫下浸泡15～16 h，至米粒用手碾之即碎；蒸煮時，上氣后蒸煮時間為20～30 min，有米飯香味即可，要求熟而不爛，透而不爛，外硬內(nèi)軟，疏松易散，均勻一致；將蒸好的飯放于紗布上，用無菌水沖冷，要邊拌邊淋，使米飯快速降溫至35 ℃左右，避免因緩慢冷卻導(dǎo)致微生物污染。

小麥：小麥除雜、清洗后，常溫下浸泡12 h（至5 %～7 %的水分，浸泡時間太長可能發(fā)芽），用手動壓面機壓至扁平狀，使心爛皮不爛；壓榨后的小麥質(zhì)地較疏松，置于常壓蒸煮器中進行蒸煮，上氣后蒸煮時間為40～50 min，中間淋水翻拌1次，以小麥?zhǔn)祜?、芯熟透為?zhǔn)。

1.2.1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

種子糟全部移入2000 mL三角瓶中，加入蒸煮后的發(fā)酵原料500 g，再按照發(fā)酵原料的180%量加入900 mL發(fā)酵用水，28 ℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中，每天稱重三角瓶的重量1次，記下稱重的時間和重量，到三角瓶的重量不再發(fā)生變化或者變化很小來確定發(fā)酵完畢，需要8～9 d。

1.2.1.5 蒸餾

發(fā)酵完畢后進行蒸餾，測定酒精度、同時制作樣品進行色譜分析，對各酒樣進行嘗評。

1.2.2 使用小曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

大米、玉米、糯米、小麥分別按照1.2.1.4.1的方式進行浸泡、蒸煮后，攤晾至30 ℃左右，按照1%添加量拌入小曲，再添加原料200 %量的發(fā)酵用水?；旌暇鶆颍糜?8 ℃恒溫室中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中觀察產(chǎn)氣量變化，根據(jù)不同樣品的發(fā)酵狀況，發(fā)酵完畢后進行蒸餾，得到各原料的小曲發(fā)酵酒。

1.2.3 使用大曲為糖化發(fā)酵劑的實驗方法

高粱浸泡、蒸煮后，使用7%～8%的大曲作為糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵期可延長至30 d。目前實驗結(jié)果顯示，實驗室大曲發(fā)酵容易感染雜菌，尚不斷摸索新的實驗方法。

綜合上述實驗方案，具體的實驗組數(shù)如圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣量變化

2.1.1 小曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣量變化

糯米、玉米、大米和小麥分別稱取500 g進行發(fā)酵，以1 %小曲為發(fā)酵劑，各發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣量變化趨勢如圖2。

圖1 實驗組數(shù)安排方案

圖2 各原料小曲發(fā)酵樣品產(chǎn)氣量變化

由于各原料的淀粉含量不同，因此其理論產(chǎn)氣量也各不相同。參考相關(guān)文獻資料，糯米淀粉含量以78%計、玉米淀粉含量為70%、大米為75%、小麥為60 %，分別以此數(shù)據(jù)計算各發(fā)酵樣品的理論產(chǎn)氣量和理論產(chǎn)酒量。以500 g原料進行產(chǎn)酒試驗，各樣品的理論產(chǎn)氣量分別為糯米209 g、玉米188 g、大米201 g、小麥161 g。

由圖2可以看出，各發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣趨勢均為由慢到快再緩慢的過程，在5～15 d產(chǎn)氣最為迅速，之后逐漸趨于平緩，發(fā)酵20 d以后的各樣品產(chǎn)氣量變化不大，后期主要是呈香呈味物質(zhì)的積累過程。

對比來看，糯米、大米和小麥發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣情況較好，而玉米發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣量遠遠低于理論值，其發(fā)酵情況不太好，分析其原因主要有兩個方面：(1)粉碎度不夠；(2)玉米未脫胚，影響產(chǎn)酒和口感。在之后的實驗中可對不足之處進行改進。

2.1.2 米曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣量變化（圖3）

分別以白曲米曲和黃曲米曲為糖化發(fā)酵劑，300 g大米為發(fā)酵原料，兩個樣品的產(chǎn)氣量變化如圖3所示。其中大米淀粉以75 %、米曲淀粉以60 %計，以此計算出理論產(chǎn)氣量為152.9 g。實際產(chǎn)氣量相當(dāng)接近理論值，發(fā)酵效果較好。

2.2 產(chǎn)酒情況

2.2.1 小曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)酒量對比

以500 g原料進行發(fā)酵，各樣品分別發(fā)酵20～25 d后，進行常壓蒸餾。見表1。

圖3 米曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)氣量變化

根據(jù)各原料的實際產(chǎn)酒狀況，在提高酒度的前提下采取分段接酒的方式，對不同酒度的酒進行分別接收和貯存。糯米和大米由于其淀粉含量均較高，因此分別得到了400 mL的高度酒，小麥和玉米分別得到了300 mL酒度較高的酒樣。

糯米酒的酒度高達50.3 %vol，大米酒和小麥酒分別達到48.6 %vol和47.0 %vol，產(chǎn)酒力均達到75%以上，發(fā)酵產(chǎn)酒情況良好。對比來看，玉米酒的酒精度為30.0 %vol，同時產(chǎn)酒力僅為40.26 %，遠遠低于其他樣品，其產(chǎn)酒效果不佳，應(yīng)該主要是與玉米的粉碎度和未脫胚有關(guān)。

2.2.2 米曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)酒量對比

使用300 g大米為發(fā)酵原料，大米白曲和大米黃曲樣品分別發(fā)酵13 d后，進行常壓蒸餾。見表2。

按照大米淀粉含量75%、米曲淀粉含量60%，以此計算出理論產(chǎn)乙醇量為159.90 g。由表2數(shù)據(jù)來看，大米黃曲和大米白曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)酒情況一樣，分兩段接酒，頭段酒精度高達55.2 %vol，總產(chǎn)酒力為90.46%，酒精得率很高。

2.3 菌種庫菌種發(fā)酵功能測評

菌種庫不同菌種，以最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，培養(yǎng)出活力旺盛的菌液。在以五糧為原料的，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎(chǔ)系統(tǒng)中，以純種或組合菌劑的方式，在試驗開始時以總量5%為標(biāo)準(zhǔn)加入，在試驗完畢后以蒸餾產(chǎn)酒的理化指標(biāo)和嘗評結(jié)果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價。

3 結(jié)論與討論

用上述菌種功能評價技術(shù)方法，對菌種庫功能菌的篩查中，發(fā)現(xiàn)有10多種原核和真核微生物功能菌，所產(chǎn)酒與對照比較，口感綿柔程度增加顯著，聞香也更加優(yōu)雅、細膩。在多次重復(fù)后，初步確定了白酒“綿柔因子”生成菌劑的微生物組成，并在川法小曲的生產(chǎn)中，進行了放大實驗。實驗樣酒經(jīng)過白酒專業(yè)評委和數(shù)家酒企主管技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)的嘗評驗證，確認了口感綿柔程度增加顯著，聞香也更加優(yōu)雅、細膩。下一步工作，一則在濃香型、清香型、醬香型生產(chǎn)企業(yè)進一步驗證白酒“綿柔因子”生成菌劑的作用，二則開展酒體香味成分的對比檢測分析，爭取找到白酒“綿柔因子”的具體成分。

表1 各小曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)酒對比

表2 米曲發(fā)酵樣品的產(chǎn)酒對比

白酒功能菌菌種庫是珍貴的科研和生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)資源，在建設(shè)和維護菌種庫的基礎(chǔ)之上，開發(fā)了菌種功能評價方法，即在實驗室建立以五糧為原料的，以自制米曲、大曲、小曲為發(fā)酵劑的白酒發(fā)酵基礎(chǔ)系統(tǒng)，再往里面添加菌種庫不同功能菌的純種或組合菌劑，以產(chǎn)酒的理化指標(biāo)和嘗評結(jié)果，對不同功能菌的純種或組合菌劑做出性能評價。針對目前市場變化，對菌種庫菌種性能評價中，我們特意篩選出能明顯增加酒體口感綿柔程度和聞香優(yōu)雅程度的一組功能菌菌劑，在川法小曲的放大生產(chǎn)中，獲得初步成功。后續(xù)研究中，既要在不同香型酒企生產(chǎn)中進一步驗證這組“綿柔因子”生成菌劑對口感、聞香的作用，又要通過對實驗樣酒的成分檢測分析，爭取在“綿柔因子”具體成分研究上獲得進一步成果。