李孟軍，周 碩，李亞青，張士昌，彭義峰，張 楠，史占良

(1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院/河北省小麥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050041；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北石家莊 050051)

小麥的每條染色體都具有與其同源染色體或其他2條部分同源染色體配對的潛力，但染色體配對在很大程度上僅限于同源染色體[1]。普通小麥5BL染色體臂上的Ph1位點(diǎn)是抑制部分同源染色體間配對和重組的主要因子[2-4]。在異源六倍體小麥中，5B染色體上的Ph1位點(diǎn)是在小麥多倍體化過程中產(chǎn)生的，它在減數(shù)分裂期間調(diào)控類二倍體化減數(shù)分裂(diploid-like meiosis)，抑制外源種屬的部分同源染色體配對，從而保證小麥異源多倍體基因組的穩(wěn)定性[5]。雖然在1958 年已鑒定了Ph基因，但由于缺乏等位變異，迄今Ph基因未被克隆[6]。Griffiths等[7]將Ph1定位在5B染色體上1段2.5 Mb區(qū)域中，該區(qū)域包含1段插入cdc2-like基因簇的亞端粒異染色質(zhì)片段。cdc2-like基因簇是此區(qū)域唯一的多基因簇，其中至少1個成員是5B染色體特有的。因此，cdc2基因是Ph1最可能的候選基因[7]。定位在小麥基因富集區(qū)5L0.5的61個標(biāo)記中，有9個位于Ph1基因區(qū)，其中7個標(biāo)記以相同順序排列定位在水稻9號染色體上450 kb區(qū)域上。在水稻450 kb區(qū)域中的91個基因中，鑒定出26個Ph1候選基因，其中5個基因與6個減數(shù)分裂特異基因(Zip1、Scp1、Cor1、RAD50、RAD51、RAD57)具有相同的結(jié)構(gòu)域[8]。利用VIGS(virus-induced gene silencing)沉默侯選ph1基因C-Ph1(candidateph1gene,C-Ph1)導(dǎo)致了小麥表現(xiàn)出與ph1突變體類似的染色體配對行為。小麥部分同源群中的C-Ph1基因具有不同的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，只有5B染色體上的拷貝在減數(shù)分?jǐn)?shù)中期Ⅰ特異性表達(dá)[9]。Sears 等[6]通過X-射線處理中國春小麥正?；ǚ郢@得了中國春ph1b突變體，該突變體能夠有效引起部分同源染色體配對和種間、屬間雜種染色體的配對。

在傳統(tǒng)的回交育種過程中，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入輪回親本的同時，往往將非輪回親本攜帶不利性狀基因的染色體片段也轉(zhuǎn)入輪回親本基因組中。因此，減小攜帶目標(biāo)基因的外源染色體片段是染色體工程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。為解決上述難題，需要做到以下兩點(diǎn)：(1) 外源目標(biāo)基因必須以易位染色體形式轉(zhuǎn)入受體親本，從而提高稀有重組體的出現(xiàn)頻率；(2) 開發(fā)高效且成本低廉的分子標(biāo)記，以便從大量雜交后代中篩選出稀有重組體[5]。

Segal等[12]根據(jù)DNA探針WPG90序列開發(fā)了分子標(biāo)記WPG90。Qu 等[13]根據(jù)AFLP擴(kuò)增片段開發(fā)了分子標(biāo)記PSR2120。Roberts等[1,14]根據(jù)RFLP標(biāo)記PSR128和PSR574分別開發(fā)了分子標(biāo)記PSR128和PSR574。王新望等[15]根據(jù)RAPD特異片段OPR7936和OPR17524開發(fā)了 SCAR標(biāo)記OPR7和OPR17，又根據(jù)大麥RFLP標(biāo)記Ph920開發(fā)了SCAR 標(biāo)記PhSCAR[16]。Mads是位于CSph1b缺失區(qū)的一個基因。雷 昊等[17]根據(jù)其DNA序列開發(fā)了分子標(biāo)記Mads，成功地將中間偃麥草攜帶抗黃矮病基因的染色體2Ai-2轉(zhuǎn)移到ph1b缺失的遺傳背景中。本研究的目的是驗(yàn)證并比較上述9個PCR分子標(biāo)記(WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、OPR7、OPR17、Ph920、PhSCAR、Mads)的特異性和穩(wěn)定性，以期篩選出理想的分子標(biāo)記，用于利用ph1b突變體的分子輔助育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

中國春ph1b突變體(CSph1b)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)孔令讓教授和李興鋒教授提供；六倍體小麥Pavonph1b突變體(Pavonph1b)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)吳佳杰博士提供；中國春、中國春缺四體(CSN5AT5B、CSN5BT5A、CSN5DT5B)，由中國科學(xué)院李義文博士提供；含有ph1的小麥品種師欒02-1、石新828、石4185、鄭麥366、濟(jì)麥22和西農(nóng)979，由河北省小麥工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 供試分子標(biāo)記

根據(jù)文獻(xiàn)合成Ph1的9對PCR引物(表1)，分別用來檢測CSph1b突變體及其轉(zhuǎn)育的突變體Pavonph1b。PCR引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 PCR檢測

PCR反應(yīng)在Biometra T-Gradient Thermoblock上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix(GenStar)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板基因組DNA 2 μL(50～100 ng)，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)并加以優(yōu)化(表2)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TAE，溴化乙錠染色觀察記錄。

1.4 序列分析

采用克隆測序方法對PSR128、Mads和PhSCAR三個標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了序列分析。PCR反應(yīng)在Biometra T-Gradient Thermoblock上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： 2× LA Taq PCR MasterMix(TaKaRa)10 μL，引物各1 μL(10μmol·L-1)，模板基因組DNA 2μL(50～100 ng)，ddH2O 6 μL?？寺≥d體為pMD18-T(TaKaRa)。測序由Invitrogen公司完成。用軟件Lasergene SeqMan II Module (DNAStar; http:/www.DNAStar.com)進(jìn)行核酸序列組裝、拼接和比對。

表1 PCR分子標(biāo)記及其引物序列Table 1 PCR marker information and primer sequences

表2 PCR擴(kuò)增程序Table 2 PCR program

2 結(jié)果與分析

通過對相關(guān)文獻(xiàn)的分析，選取了其中9個分子標(biāo)記，以11個基因組DNA為模板，對這9個分子標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證和比較。在9個分子標(biāo)記中，Mads是根據(jù)CSph1b缺失區(qū)的Mads基因開發(fā)的，其余8個標(biāo)記為根據(jù)RFLP、AFLP和PAPD標(biāo)記開發(fā)的SCAR標(biāo)記。為了簡化PCR操作，提高PCR檢測效率，本研究中PCR擴(kuò)增均以基因組DNA為模板，采用了相同的PCR擴(kuò)增體系，并對每個標(biāo)記的PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行了簡化和優(yōu)化(表2)。

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，9個標(biāo)記中，WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、Ph920、Mads為顯性標(biāo)記，在CSph1b突變體和Pavonph1b突變體中無擴(kuò)增，而在含有Ph1的小麥品種中，這6個標(biāo)記均擴(kuò)增出特異的單一條帶，片段大小分別為230 bp、232 bp、260 bp、154 bp、920 bp和323 bp(PCR產(chǎn)物直接測序)，符合預(yù)期[5,12-14,16-17]。CSph1b突變體、Pavonph1b突變體和中國春缺四體CSN5BT5A PCR擴(kuò)增帶型一致，這表明Ph1位點(diǎn)位于5B染色體上，Pavonph1b突變體來自CSph1b突變體[4](圖1)。標(biāo)記Ph920采用參考文獻(xiàn)的PCR程序，CSph1b突變體、Pavonph1b突變體和中國春缺四體CSN5BT5A有較弱的非特異性擴(kuò)增。標(biāo)記PSR2120有引物二聚體產(chǎn)生，通過調(diào)整退火溫度無法消除引物二聚體。標(biāo)記WPG90對退火溫度非常敏感，僅在58 ℃有微弱的PCR擴(kuò)增。標(biāo)記PSR128和標(biāo)記PSR574擴(kuò)增條帶特異、清晰、單一，同時，2個標(biāo)記PCR擴(kuò)增對退火溫度不敏感，適宜作為多重PCR擴(kuò)增引物。標(biāo)記OPR7和標(biāo)記OPR17在所有DNA模板中均有擴(kuò)增，無法區(qū)分CSph1b突變體和Pavonph1b突變體，是非特異PCR標(biāo)記，與預(yù)期不符[17]。標(biāo)記PhSCAR在所有DNA模板中均有擴(kuò)增條帶，但CSph1b突變體、Pavonph1b突變體、中國春缺四體CSN5BT5A三個材料與其他8個材料的PCR擴(kuò)增帶型不同，與預(yù)期不符[16]。標(biāo)記PhSCAR在CSph1b突變體、Pavonph1b突變體和中國春缺四體CSN5BT5A中擴(kuò)增出單一條帶，而在含有Ph1的小麥品種中均擴(kuò)增出2個條帶，這種擴(kuò)增特征穩(wěn)定，因此，標(biāo)記PhSCAR可作為共顯性標(biāo)記使用(圖1)。

A：WPG90；B：PSR2120；C：PSR128；D：PSR574；E：OPR7； F：OPR17；G：Ph920；H：Mads；I：PhSCAR。M：DNA marker(DL2000)；1：CSph1b；2：Pavonph1b；3：CSN5AT5B；4：CSN5BT5A；5：CSN5DT5B；6：師欒02-1；7：石新828；8：石4185；9：鄭麥366；10：濟(jì)麥22；11：西農(nóng)979；12：ddH2O。

A:WPG90; B:PSR2120; C:PSR128; D:PSR574; E:OPR7; F:OPR17; G:Ph920; H: Mads;I：PhSCAR.M: DNA marker(DL2000); 1:CSph1b; 2:Pavonph1b; 3:CSN5AT5B; 4:CSN5BT5A; 5:CSN5DT5B; 6:Shiluan 02-1; 7:Shixin 828; 8:Shi 4185; 9:Zhengmai 366; 10:Jimai 22; 11:Xinong 979; 12:ddH2O.

圖1 9個DNA分子標(biāo)記的PCR檢測結(jié)果

Fig.1 PCR assay amplified with the nine molecular markers

標(biāo)記Mads擴(kuò)增中，退火溫度不同，CSph1b突變體、Pavonph1b突變體和中國春缺四體CSN5BT5A PCR擴(kuò)增帶型不同。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果表明，PCR帶型的差異是因?yàn)闃?biāo)記Mads的上鏈引物和下鏈引物各自分別發(fā)生了擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度分別為878 bp和1584 bp[17](圖2B)。

A：Mads (Tm=64 ℃)；B：Mads(Tm=56 ℃)。M：DNA marker(DL2000)；1：CSph1b；2：Pavonph1b；3：CSN5AT5B；4：CSN5BT5A；5：CSN5DT5B；6：師欒02-1；7：石新828；8：石4185；9：鄭麥366；10：濟(jì)麥22；11：西農(nóng)979；12：ddH2O。

A: Mads (Tm=64 ℃); B:Mads (Tm=56 ℃).M:DNA marker(DL2000); 1:CSph1b; 2:Pavonph1b; 3:CSN5AT5B; 4:CSN5BT5A; 5:CSN5DT5B; 6:Shiluan 02-1; 7:Shixin 828; 8:Shi 4185; 9:Zhengmai 366; 10:Jimai 22; 11:Xinong 979; 12:ddH2O.

圖2 分子標(biāo)記Mads在不同退火溫度下的PCR檢測結(jié)果

Fig.2 PCR assay amplified with Mads at different annealing temperatures

3 討 論

黑麥屬、偃麥草屬、冰草屬、簇毛麥等普通小麥近緣種屬蘊(yùn)藏著普通小麥缺乏的優(yōu)良基因，通過遠(yuǎn)緣雜交將其優(yōu)良基因?qū)胄←溁蚪M中，對普通小麥遺傳改良具有重要意義。Ph1b突變體可誘導(dǎo)普通小麥與近緣物種部分同源染色體的重組[4]，通過與部分同源染色體配對重組創(chuàng)制的普通小麥外源染色體小片段易位系，可減少近緣物種攜帶目標(biāo)基因的染色體片段對小麥農(nóng)藝性狀的不利影響。CSph1b突變體為春性小麥且農(nóng)藝性狀較差，通過回交創(chuàng)制適宜本區(qū)域農(nóng)藝性狀優(yōu)良的ph1b突變體，有利于提高ph1b的育種利用價值[16]。利用ph1b突變體創(chuàng)制普通小麥和外源染色體重組體效率較低，且需采用特定的雜交策略，因此，在回交過程中采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可以顯著加速新種質(zhì)創(chuàng)制進(jìn)程，甚至決定新種質(zhì)選育的成敗[6]。

王新望等[16]以阿勃5B缺體為橋梁親本，京411為受體親本, CSph1b突變體為供體親本，經(jīng)減數(shù)分裂分析和PhSCAR標(biāo)記輔助選擇，快速地選育了京411的ph1b中間代換系。雷昊等[17]用CSph1b分子標(biāo)記Mads 及2Ai-2 染色體的分子標(biāo)記P4和P68高效獲得了小麥-中間偃麥草ph1b-2Ai-2 染色體綜合體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子標(biāo)記WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、Ph920、Mads能夠用于ph1b純合單株選擇，其中標(biāo)記PSR128、PSR574和Mads從特異性、重復(fù)性方面考慮適用于分子標(biāo)記輔助選擇，但標(biāo)記Mads需要注意退火溫度的選擇。標(biāo)記PhSCAR與前人研究結(jié)果[16]不同，PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物測序結(jié)果表明，標(biāo)記PhSCAR可作為共顯性標(biāo)記使用。共顯性標(biāo)記的PCR分子標(biāo)記可有效避免顯性分子標(biāo)記中的假陰性現(xiàn)象。在ph1b株系選擇時，標(biāo)記PhSCAR與PSR128、PSR574、Mads配合使用可相互驗(yàn)證，從而減少雜交和選擇的工作量，提高鑒定的準(zhǔn)確性。標(biāo)記OPR7和OPR17無法有效區(qū)分ph1b株系，這與前人研究結(jié)果[15]不同，具體原因需進(jìn)一步研究。