劉家汝， 王超，關(guān)秀茹

動脈粥樣硬化（AS）是一種以血管內(nèi)皮損傷為始點，伴隨著炎癥、免疫反應(yīng)以及脂質(zhì)浸潤等多過程的綜合性病變[1]。損傷血管壁以及引起炎癥反應(yīng)是吸煙、高脂血癥等因素誘發(fā)動脈粥樣硬化的主要原因，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的凋亡、壞死、巨噬細(xì)胞分化等。因此，尋找動脈粥樣硬化的新型分子標(biāo)志物是我們的研究重點。

高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，非編碼RNA（ncRNA）約占人類基因組的70%以上[2]。ncRNA包括小干擾RNAs（siRNAs），微小RNAs（miRNAs）和長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）等[3]。其中，miRNAs作為一種長度約為21～23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA已被證實普遍活躍在多種疾病的形成中[4]。這是因為miRNAs可結(jié)合mRNAs互補序列的3′UTR調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達，通過阻斷mRNA翻譯和加速mRNA降解來降低蛋白質(zhì)表達[5]，不斷改變細(xì)胞或組織的生理功能。另外，一直被視為“垃圾”的長鏈非編碼RNA—lncRNAs，近年來被發(fā)現(xiàn)可以彌合核酸和蛋白質(zhì)間的間隙，成為蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)錄和翻譯的完整支架[6]，在肝膽、心血管、腎臟等多種疾病中發(fā)揮作用。此外，環(huán)形RNAs（circRNAs）是一種沒有3′和5′末端的共價閉合環(huán)狀非編碼RNA，更是心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病和腫瘤等一系列領(lǐng)域的研究熱點[7]。

2011年P(guān)ier Paolo Pandolfi等首次提出了“ceRNA假說”，即細(xì)胞內(nèi)存在競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），這些ceRNA分子（lncRNA、circRNA、mRNA等）通過競爭miRNA的結(jié)合位點（MRE，又稱miRNA應(yīng)答元件）來影響miRNA功能和相關(guān)的mRNA表達，發(fā)揮其生物學(xué)作用，這種競爭性結(jié)合miRNA的作用稱為miRNA“海綿”作用，該機制又被描述為細(xì)胞內(nèi)前饋調(diào)控回路[8,9]。大量前沿研究表明，非編碼RNA（ncRNA）廣泛參與調(diào)控動脈粥樣硬化發(fā)生的各個階段。本文就ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特征及近年來其與動脈粥樣硬化的相關(guān)研究進行綜述。

1 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在動脈粥樣硬化中對內(nèi)皮細(xì)胞的作用

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和所有組織間的重要界面。當(dāng)動脈血管受到多種因素，如炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、高血壓和高血糖時，內(nèi)皮細(xì)胞將維持血管穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮“屏障”作用[10]。同樣，內(nèi)皮細(xì)胞活性和功能衰退是誘發(fā)動脈粥樣硬化的條件之一，在此過程中ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)扮演著不可替代的角色。

1.1 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡lncRNA MALAT1作為ceRNA與miR-22-3p競爭，上調(diào)其靶基因CXCR2和AKT的表達，保護內(nèi)皮細(xì)胞，避免ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷及其功能障礙[11]。另有研究表明，敲除臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MALAT1促進miR-320a水平升高，miR-320a可直接靶向并抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞FOXM1表達，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[12]。MIAT作為ceRNA螯合miR-150-5p后減輕其對VEGF表達的抑制作用，競爭性調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活[13]。Shan等[14]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA RNCR3在小鼠和人主動脈粥樣硬化病變中的表達明顯上調(diào)，并且敲除RNCR3將抑制體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和加速細(xì)胞凋亡。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，RNCR3作為ceRNA通過RNCR3/miR-185-5p/KLF2網(wǎng)絡(luò)調(diào)控途徑參與調(diào)節(jié)動脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能損傷，防止血管內(nèi)皮損傷。Wu等[15]認(rèn)為，TNF-α可有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞MEG3水平升高，后者在一定程度上抑制miR-21表達調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及I型膠原、V型膠原和蛋白多糖的生成，與早期粥樣斑塊的形成有關(guān)。同時，Ming等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA SIRT1 AS/miR-22/SIRT1軸與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞衍生過程密切相關(guān)。

此外，ceRNA也普遍作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的不同環(huán)節(jié)。高表達lncRNA TUG1可去除丹參酮對ox-LDL所誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用，這一過程通過TUG1/miR-26軸實現(xiàn)[17]。來源于線粒體的lncRNA—ASncmtRNA-2則有效延緩G2/M期細(xì)胞周期阻滯的復(fù)制衰老，這可能與miR-4485和miR-1973有關(guān)[18]。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)lncRNA LOC100129973作用于miR-4707-5p和miR-4767，上調(diào)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的基因—API5和BCL2L12，輔助維持內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)定。相反，lncRNA LINC00305作為miR-136的“分子海綿”，正向調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[20]。

1.2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與內(nèi)皮細(xì)胞自噬自噬是一種細(xì)胞自我清除、糾正的方式，依賴于雙膜自噬體降解長壽蛋白、錯誤折疊蛋白、過量或有缺陷的細(xì)胞器。研究發(fā)現(xiàn)，自噬不僅能降解大分子物質(zhì)和細(xì)胞器來保護細(xì)胞存活，而且通過自噬作用介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，促進膽固醇外流、減少細(xì)胞凋亡、干預(yù)胞葬作用并減弱炎癥信號，負(fù)向調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化過程[21,22]。自噬與動脈粥樣硬化之間復(fù)雜而微妙聯(lián)系早已不足為奇，但ceRNA對細(xì)胞自噬的詳細(xì)調(diào)控機制尚未明確。

Huang等[23]證明CERS1（神經(jīng)酰胺合成酶1）、NAT8L（神經(jīng)酰胺合成酶1）和LARP1（La核糖核蛋白結(jié)構(gòu)域家族成員1）分別是調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化發(fā)展過程中自噬和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白：CERS1和NAT8L介導(dǎo)線粒體功能紊亂改變自噬水平；LARP1表達水平升高將促進SQSTM 1/p62的表達,活化NFKB RELA、CASP1，刺激VECs中IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生。該研究還表明，TFGB2-OT1通過作用于CERS1、NAT8以及LARP1三個不同的靶點結(jié)合miR-3960、miR-4488和miR-4459，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬及炎癥反應(yīng)。Ge等[24]發(fā)現(xiàn)，lncRNA FLJ11812作為miR-4459的“分子海綿”靶向調(diào)節(jié)ATG13的表達間接影響內(nèi)皮細(xì)胞自噬。由此可見，TGFB2-OT1和lncRNA FLJ11812可為動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供新的方向。

2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在動脈粥樣硬化中對平滑肌細(xì)胞的作用

平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡會顯著影響泡沫細(xì)胞和纖維斑塊的形成以及氧化應(yīng)激等過程。在血管平滑肌細(xì)胞中，ceRNA網(wǎng)絡(luò)將覆蓋其增殖、死亡等多個過程并以多種方式改變動脈血管的狀態(tài)。

2.1 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡Wnt1是Wnt家族成員，Wnt信號已被證明是介導(dǎo)AS發(fā)展的重要調(diào)控通路[25]。Wnt1是miR148b的作用靶點，lncRNA H19可作為miR-148b的ceRNA來增強HA-VSMCs（人主動脈平滑肌細(xì)胞）中靶基因WNT1的表達，進而通過活化Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路發(fā)揮促進血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及抑制細(xì)胞凋亡的作用。同時Zhang等[26]敲除lncRNA H19后發(fā)現(xiàn)該信號通路被阻斷。由此看來H19極具有預(yù)防AS的潛在應(yīng)用價值。血管中膜平滑肌細(xì)胞中含有一種與動脈粥樣硬化發(fā)展相關(guān)的lncRNA—APPAT，Meng等[27]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ox-LDL刺激的VSMCs中APPAT的表達水平較低，而其靶基因miR-647的表達水平較高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，APPAT與靶向miR-647的相反表達趨勢可能是由于ceRNA的調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致其在組織和循環(huán)血液中表達相應(yīng)的變化。微陣列數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析表明，胰腺纖維化過程中SXT12作為miR-148a的ceRNA，抑制miR-148a對SAMD5的影響，加速α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）分泌[28]，后者在平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡以及粥樣斑塊形成和發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用。除了lncRNA，circRNA也可扮演ceRNA的“角色”。高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中circRNA WDR77明顯升高，circWDR77通過靶向miR-124/FGF-2調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

2.2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與平滑肌細(xì)胞自噬血管重塑過程中平滑肌細(xì)胞的異常去分化、表型轉(zhuǎn)換及其后續(xù)增殖會導(dǎo)致多種血管疾病，包括動脈粥樣硬化、支架內(nèi)再狹窄、術(shù)后移植血管病變等。自噬相關(guān)基因在血管平滑肌細(xì)胞中的高表達有助于維持平滑肌細(xì)胞靜止和分化狀態(tài)的平衡，防止平滑肌細(xì)胞異常去分化。Song等[29]證明MALAT1作為miR142-3p的分子誘餌或“海綿”，調(diào)節(jié)ATG7的表達，激活自噬，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向增殖表型轉(zhuǎn)變。

3 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在動脈粥樣硬化中對巨噬細(xì)胞和炎癥反應(yīng)的作用

動脈粥樣硬化早期，巨噬細(xì)胞可通過清道夫受體無限攝入ox-LDL，使得ox-LDL過度沉積于巨噬細(xì)胞中，形成特征性的泡沫細(xì)胞和脂紋，最終發(fā)展成為粥樣斑塊[30,31]。此外，動脈粥樣硬化伴隨大量炎癥因子的釋放，而在其龐大的炎癥反應(yīng)體系中miRNAs的影響似乎無處不在。

Hu等[32]分析發(fā)現(xiàn)RP5-833A20.1位于NFIA的內(nèi)含子區(qū)域與NFIA轉(zhuǎn)錄方向相反。經(jīng)過miR-382介導(dǎo)，lncRNA RP5-833A20.1負(fù)性調(diào)控NFIA翻譯過程，增加TNF、IL-1β和IL-6炎性細(xì)胞因子表達，降低膽固醇外流。另有研究證實，轉(zhuǎn)錄因子PU.1調(diào)控lncRNA lnc-MC與miR-199a-5p的結(jié)合，高表達下游靶基因ACVR1B，促進單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化[33]。Ye等[34]認(rèn)為高表達GAS5誘導(dǎo)促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及巨噬細(xì)胞MMPs釋放。在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中GAS5可競爭miR-221，增強炎癥反應(yīng)，并于動脈粥樣硬化后期加速纖維帽降解，加劇粥樣斑塊的不穩(wěn)定性。在lnc-MKI67IP-3、let-7e和lκBβ所組構(gòu)成的ceRNA干擾系統(tǒng)的調(diào)控下，let-7e反饋性降低lnc-MKI67IP-3的表達，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[35]。

4 前景與展望

迄今為止共有19 667個基因被稱為蛋白質(zhì)編碼基因，其中約17 470個在蛋白質(zhì)水平上已被證實，其余98%的人類基因組中相當(dāng)一部分可轉(zhuǎn)錄成“非編碼RNA”（ncRNA）[36]。其中miRNA高度保守的非編碼 RNA分子在心血管疾病炎癥和代謝方面的作用已被發(fā)現(xiàn)。存在于各種特異性組織或細(xì)胞中的miRNAs，如VCAM-1、miR-155、miR-181、miR-424、miR-223等，表達水平的高低將直接或間接影響血管炎癥以及細(xì)胞代謝過程[37]。然而，由于miRNAs的多靶點作用機制及動脈粥樣硬化各階段病理性改變的復(fù)雜性，miRNAs可以通過多種分子或通路影響動脈粥樣硬化發(fā)生，因此許多未知機制仍需深入探究。

lncRNAs（長度大于200個核苷酸的ncRNAs）在人類細(xì)胞中的表達水平通常較低，但組織特異性較高，轉(zhuǎn)錄過程也更為嚴(yán)格[38]。迄今為止，數(shù)以千計已知的lncRNAs已被報道。lncRNAs被公認(rèn)為是一類高度通用的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)器，且不受管制的lncRNAs表達可能存在于氧化應(yīng)激、物質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)等過程。但是，想要全面探究lncRNAs功能的有效性就不能局限于體外實驗，有關(guān)lncRNA在動脈粥樣硬化中的許多結(jié)論仍需在動物體內(nèi)或臨床水平加以證實。

大量證據(jù)表明，各種類型的RNAs可以在不同生理和病理狀態(tài)下充當(dāng)ceRNA發(fā)揮作用，包括假基因、lncRNAs、circRNAs和mRNAs等[39]。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有多樣性，同一lncRNA在不同的組織和細(xì)胞中與不同的miRNA競爭所產(chǎn)生的生物效應(yīng)也不盡相同。例如，MALAT1/miR142-3p/ATG7機制誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換；而在內(nèi)皮細(xì)胞中MALAT1又可與miR-320a競爭上調(diào)FOXM1水平，參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖。目前關(guān)于ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究仍無法清楚的確定lncRNA和靶基因在動脈粥樣硬化中的表觀遺傳作用和異常狀態(tài)。因此，在未來的研究中需進一步擴大對ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識，提升對動脈粥樣硬化研究的高度[40]。