冉鳳英 陳龍 羅丹 陳琴華,2

間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）主要的生物學(xué)特性包括高度的自我更新、多向分化及獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力，其免疫調(diào)節(jié)能力則主要是通過(guò)MSCs 與先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用，分泌細(xì)胞調(diào)節(jié)性因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[1-3]。研究表明，來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（exosomes from mesenchymal stem cells，MSCs-Exo）在組織的修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)及疾病的治療過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可能為臨床疾病診斷和治療提供新的策略[4-5]。因此，了解MSCs-Exo 的生物學(xué)特性、免疫調(diào)節(jié)能力和臨床研究現(xiàn)狀將為MSCs-Exo 在組織損傷修復(fù)及其他臨床疾病的研究提供理論依據(jù)。

一、MSCs-Exo 的生物學(xué)特性

1.基本的特征：1980年發(fā)現(xiàn)的外泌體（exosome）大多為微小囊泡，直徑約為30 ～200 nm，在蔗糖溶液中的密度為1.10 ～ 1.18 g/mL，可由各種細(xì)胞分泌[6-7]。MSCs-Exo 不僅表達(dá)所有外泌體共同表達(dá)的蛋白標(biāo)志物，還表達(dá)MSCs細(xì)胞膜表面的一些黏性分子 （如：CD90、CD105、CD29、CD44、CD73）[8]。同時(shí)，也存在一些其他種類(lèi)的蛋白如Alix、TSG101、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、膜聯(lián)蛋白 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和 Ⅵ）及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和組織相融性抗原。另外，MSCs- Exo 富含膽固醇和鞘磷脂，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，從MSCs-Exo 中分離得到的脂肪酸主要有花生四烯酸、二十二碳六烯酸、白三烯、磷脂酸和前列腺素溶血磷脂酰膽堿[9]。外泌體中的脂質(zhì)成分可因其來(lái)源不同而表現(xiàn)出一定的差異，這些脂類(lèi)的主要作用是維持外泌體的形態(tài)和作為信號(hào)分子參與生物信息傳遞。除此之外，MSCs-Exo內(nèi)還含有大量的RNA （microRNA和mRNA），少量線粒體DNA （mtDNA）、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）、核糖體 RNA （rRNA）、piRNA、tRNA、snoRNA 和snRNA[10]。

2.提取、保存和鑒定：現(xiàn)有的外泌體提取及分離技術(shù)主要包括超速離心技術(shù)、超濾技術(shù)、聚乙二醇沉淀、免疫磁珠捕獲技術(shù)以及微尺度和納米尺度的微流控芯片技術(shù)[11-15]，而這些技術(shù)在提取外泌體時(shí)都各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇提取方法時(shí)應(yīng)根據(jù)分離原理、樣本量及后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求合理選擇[16-19]。成功分離的外泌體若不進(jìn)行后續(xù)研究，如何合理保存是科研過(guò)程中需要考慮的一個(gè)重要問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，保存環(huán)境對(duì)外泌體的直徑及完整性有較大的影響，將提取好的外泌體放于室溫條件下2 d，發(fā)現(xiàn)其直徑下降60%；4 ℃放至4 ～5 d 直徑下降25%；-20 ℃較短時(shí)間保存直徑未發(fā)生明顯變化；而-80 ℃保存在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)外泌體保持穩(wěn)定，同時(shí)，如果反復(fù)凍融外泌體樣本，也會(huì)導(dǎo)致其RNA 含量降低[20-21]?？傊崛〕晒Φ耐饷隗w要盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且每次用于實(shí)驗(yàn)研究的外泌體保存條件應(yīng)保持一致，避免人為因素導(dǎo)致每次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。

外泌體的鑒定是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，只有保證外泌體的純度和活性才能確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可信度。外泌體的鑒定通常需要通過(guò)形態(tài)、粒徑分布和蛋白標(biāo)志物等綜合考量，而目前用于鑒定外泌體的技術(shù)主要包括掃描電鏡 （scanning electron microscope，SEM）、原子力顯微術(shù) （atomic force microscopy，AFM）、動(dòng)態(tài)光散射 （dynamic light scattering，DLS）、納米粒子跟蹤分析 （nanoparticle tracking analysis，NTA）、透射電鏡術(shù) （transmission electron microscopy，TEM）、流 式 細(xì)胞檢測(cè)分析 （flow cytometry analysis，F(xiàn)CAs）、免疫印跡技術(shù) （Western blot，WB）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等[22]。鑒定外泌體時(shí)通常聯(lián)合使用以上2 或3 種方法，而在大多數(shù)研究中，NTA、TEM和WB 技術(shù)常常被認(rèn)為是鑒定外泌體的首選方法[23]。

二、MSCs-Exo 免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明，MSCs 可以通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸或旁分泌方式調(diào)解T 細(xì)胞的功能，而且MSCs 在抑制細(xì)胞因子的分泌和抑制配體-受體相互作用的功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用?；谶@一假設(shè)，MSCs- Exo 被認(rèn)為可以通過(guò)這一機(jī)制誘導(dǎo)外周耐受性T 細(xì)胞的耐受性分子。Mokarizadeh 等[24]研究表明MSCs 分泌的微泡能夠抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的分泌包括白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）等。近年來(lái)，隨著對(duì)外泌體研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體可以有效激活或抑制免疫反應(yīng)[25]。外泌體在免疫細(xì)胞信息通訊中的一個(gè)重要作用是參與抗原呈遞。Zhang 等[26]研究表明，MSCs- Exo 通過(guò)激活M2 型巨噬細(xì)胞，抑制M1 型巨噬細(xì)胞，以及增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子IL-10 和TGF- β 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)，以促進(jìn)組織修復(fù)。Chen 等[27]研究發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo能夠抑制IL-1β 和TNF- α 的分泌，促進(jìn)TGF-β 分泌，進(jìn)一步研究表明MSCs-Exo 能夠誘導(dǎo)Th1 向Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，外泌體以MSCs 類(lèi)似的方式通過(guò)減少炎癥和促進(jìn)抗炎反應(yīng)來(lái)抑制促炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

另有研究發(fā)現(xiàn)外泌體不僅能在免疫細(xì)胞分子間呈遞抗原和信息分子，還能通過(guò)RNA 的方式在細(xì)胞間傳遞遺傳信息。外泌體可以將miRNAs 傳遞給受體細(xì)胞，然后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，如：在低氧培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs 分泌的外泌體中含有傷口愈合相關(guān)的miRNA，如miR-223、miR-146b、miR- 126 和miR-199a，而這些外泌體可以調(diào)整肌肉損傷模型中M1/M2 平衡[28-29]。另外，一些MSCs-Exo 的miRNAs 在許多組織中調(diào)節(jié)不同的炎癥反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用，也影響免疫細(xì)胞的表型[30-31]，如：miR-34a、miR-122、miR-124 和miR-127 能夠使機(jī)體抗炎和抗增殖水平增加；而miR-21 和miR- 181 失調(diào)誘導(dǎo)慢性炎癥，并且這種miRNA 在控制初始促炎和遲發(fā)免疫調(diào)節(jié)之間的平衡起著關(guān)鍵性的作用[32]。此外，如果將含有miRNA-146a 的MSCs- Exo 轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中，其可以通過(guò)向M2 型巨噬細(xì)胞極化增加機(jī)體的抗炎反應(yīng)，使膿毒癥小鼠的存活率提高[31]。

三、MSCs-Exo 在臨床疾病治療中的研究

1.MSCs-Exo 在傷口愈合和皮膚再生中的應(yīng)用：MSCs參與皮膚傷口愈合的整個(gè)過(guò)程，而外泌體是MSCs 釋放的關(guān)鍵因子之一，具有MSCs 相似的功能，可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞自我修復(fù)和組織再生，加速損傷部位的傷口修復(fù)[33]。研究表明，MSCs-Exo 可以促進(jìn)受體巨噬細(xì)胞向抗炎M2 型轉(zhuǎn)變，此外，還能調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞的活化、分化和增殖，并能抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖。MSCs-Exo 還可將活化的T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫促進(jìn)作用[34-35]。另外，在許多疾病模型中，MSCs- Exo 可以促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的上調(diào)（如：IL-10），而據(jù)報(bào)道，IL-10 在調(diào)節(jié)皮膚傷口炎癥和瘢痕形成中起著至關(guān)重要的作用[36]。Geiger 等[37]發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo 可通過(guò)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中皮膚細(xì)胞的遷移和增殖來(lái)加速傷口愈合。各種研究表明，MSCs-Exo 還可通過(guò)特定的miRNAs 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，Li 等[38]發(fā)現(xiàn)攜帶miRNA-181c 的臍帶MSCs- Exo 通過(guò)下調(diào)Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路，減輕燒傷引起的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。綜上研究表明，MSCs-Exo 在傷口愈合的整個(gè)階段發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用?；诖藱C(jī)制MSCs-Exo 將有望用于臨床免疫系統(tǒng)類(lèi)疾病的治療。

2.MSCs-Exo 在腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用：MSCs- Exo 在腫瘤的發(fā)生、血管生成和轉(zhuǎn)移中的作用，研究者們持有不同的觀點(diǎn)。Qi 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中MSCs-Exo 能夠通過(guò)激活骨肉瘤和胃癌細(xì)胞株中的Hedgehog 信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；Vallabhaeni 等[40]指出，MSCs-Exo 通過(guò)傳遞miRNA-21和miR- 34a，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；MSCs- Exo 將mRNAs 和miRNAs 轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)血管生成和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的形成，而胎盤(pán)MSCs-Exo已被證明可促進(jìn)胎盤(pán)微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成[41-42]。雖然MSCs-Exo 在很大程度上介導(dǎo)了腫瘤微環(huán)境中的腫瘤促進(jìn)作用，但也有證據(jù)表明MSCs-Exo 具有抗腫瘤活性。Wu等[43]報(bào)道，來(lái)自人臍帶的MSCs- Exo 可能通過(guò)下調(diào)磷酸化的AKT 蛋白激酶和上調(diào)caspase-3 來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞的發(fā)育；同樣地，來(lái)源于MSCs-Exo 通過(guò)降低Bcl-xL 的活性和通過(guò)caspase-3/7 途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)傳遞miR- 145來(lái)抑制前列腺癌[44]；另外，從正常人骨髓MSCs 中獲得的外泌體可抑制肝癌和卵巢腫瘤細(xì)胞株的增殖，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[45]。Roccaro 等[46]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓MSCs-Exo 可以促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，而從正常個(gè)體中分離的外泌體則表現(xiàn)出相反的作用，其可通過(guò)轉(zhuǎn)移較低含量的miR-15a 來(lái)抑制多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。綜上研究表明，外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用可能因其來(lái)源和腫瘤細(xì)胞類(lèi)型不同而表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)作用。具體作用機(jī)制還需后續(xù)深入研究。

3.MSCs-Exo 在神經(jīng)損傷中的應(yīng)用：MSCs-Exo 可以將許多遺傳物質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和蛋白質(zhì)傳遞到軸突，恢復(fù)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)軸突再生、促進(jìn)神經(jīng)形成和血管生成[47]。Wei 等[48]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于骨髓的MSCs-Exo 具有支持血管形成作用，可抑制外周血單核細(xì)胞分泌IFN-γ，內(nèi)含有免疫相關(guān)microRNA（miR-301、miR-22、miR-let-7a 等），能促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成；最近研究發(fā)現(xiàn)特 定 的miRNAs （miR-23a、miR-200、miR-133b、miR-17-92等）過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)神經(jīng)基因和髓鞘化的形成，而在這過(guò)程中主要是外泌體將miRNAs 從神經(jīng)元細(xì)胞體轉(zhuǎn)移到軸突，從而介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)[49]；此外，有研究報(bào)道稱(chēng)牙齦來(lái)源的MSCs-Exo 能夠誘導(dǎo)分化（修復(fù)）表型相關(guān)基因的上調(diào)，從而促進(jìn)外周神經(jīng)細(xì)胞的再生[50]；Huang 等[51]發(fā)現(xiàn)PEDF 修飾的脂肪MSCs-Exo 可以激活細(xì)胞自噬，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而改善腦損傷；另外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MSCs- Exo 還可通過(guò)傳遞miR-30d-5p 來(lái)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬，最終促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型的極化，從而逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的損傷，本研究不僅解釋了MSCs-Exo 介導(dǎo)神經(jīng)炎癥促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制，而且還提示MSCs-Exo 可能是一種很有前途的基因傳遞載體，可以減輕神經(jīng)炎癥[52-53]。雖然目前許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，利用MSCs-Exo 治療周?chē)窠?jīng)損傷是有效和安全的，但這一領(lǐng)域還有待進(jìn)一步研究，需要大量的工作來(lái)充分確定MSCs-Exo在臨床應(yīng)用中的潛力。

4.MSCs-Exo 在肝損傷和腎損傷中的應(yīng)用：在肝臟疾病相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，MSCs-Exo 也表現(xiàn)出一定的保護(hù)和治療作用。Du 等[54]研究證明人誘導(dǎo)的多能MSCs-Exo 通過(guò)激活SPhks 和s1p 信號(hào)通路保護(hù)肝臟免受肝缺血/再灌注損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而這一發(fā)現(xiàn)將可能有助于促進(jìn)肝臟再生方面的研究，并對(duì)急性肝病新治療方法有重要的意義；Li 等[55]研究發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo 在小鼠肝纖維化模型中有治療作用，采用四氯化碳 （carbon tetrachloride，CCL4）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)人臍帶MSCs-Exo 可以通過(guò)抑制肝細(xì)胞上皮間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和膠原蛋白的生成來(lái)改善肝纖維化；Hu 等[56]也證明人脂肪MSCs-Exo 可以分泌各種細(xì)胞因子 （如：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等），促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和維持肝功能。目前，腎損傷相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也表明，外泌體中攜帶的miRNA 和蛋白能夠減輕腎缺血再灌注損傷，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而修復(fù)腎損傷[57]。Jia 等[58]發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo 可以通過(guò)調(diào)節(jié)ATG16L 增強(qiáng)細(xì)胞自噬，預(yù)防順鉑藥物所致的急性腎損傷；另有一研究組分析了人胚胎和骨髓來(lái)源MSCs-Exo 中的蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，外泌體中含有與血管生成（VEGF、促血管新生蛋白因子）、炎癥（TNF-α）和TGF-β 信號(hào)相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)蛋白分子，可以促進(jìn)腎組織再生[59]。以上研究結(jié)果表明，外泌體對(duì)于肝和腎損傷的療效是肯定的，外泌體中攜帶的miRNA 和蛋白是治療肝損傷和腎損傷的關(guān)鍵性物質(zhì)，因此，在今后的研究中還需深入研究其治療作用機(jī)制，以便早日用于臨床治療。

5.MSCs-Exo 在其他疾病治療中的應(yīng)用：研究表明，MSCs-Exo 在其他疾病的診斷和治療中也具有重要意義。通過(guò)分析miRNA-136、miRNA-494 和miRNA-495 在外泌體內(nèi)的表達(dá)可用于子癇早期診斷；體外模擬腦缺血微環(huán)境，采用腦缺血組織提取物刺激 MSCs 提取其外泌體，以此獲得的MSCs-Exo 含有多種神經(jīng)源性和血管生成因子，可用于治療腦卒中[60]；另外，MSCs-Exo對(duì)難治性黃斑裂孔也具有促愈合作用，并且MSCs-Exo 還可用于治療1 型糖尿病、心腦血管疾病、腦中風(fēng)和骨關(guān)節(jié)炎等疾??；此外，因MSCs-Exo 特有的生物結(jié)構(gòu)還可將其作為藥物載體發(fā)揮治療作用。所以，隨著對(duì)MSCs-Exo 研究的深入，將促使其早日用于臨床疾病的治療。

眾多研究表明，MSCs-Exo 能夠模擬MSCs 的生物學(xué)功能，外泌體可以通過(guò)靶細(xì)胞以膜融合或者內(nèi)吞作用釋放生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)組織修復(fù)及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用；外泌體相比于MSCs 更穩(wěn)定、更安全，而且體積小，不容易堵塞血管；還能穿過(guò)質(zhì)膜，降低免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。而且，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的microRNA 是外泌體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，外泌體可同時(shí)誘導(dǎo)Th1 轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)h2 細(xì)胞，并抑制Th17 細(xì)胞的分化，提示外泌體在治療一些免疫性疾病上具有廣闊的前景。另外，外泌體中含有多種蛋白質(zhì)及生物遺傳物質(zhì)，因此可以將蛋白質(zhì)和大分子遺傳物質(zhì)裝載到外泌體上，這樣外泌體將可成為理想的藥物載體?？偠灾S著對(duì)外泌體的深入研究，外泌體將有可能替代MSCs 用于臨床協(xié)助疾病的治療和診斷。