王雅芬，蘇靜波，王雨生，惠延年，郭長(zhǎng)梅

0 引言

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是新生兒失明的主要原因之一，其發(fā)病過(guò)程包括兩個(gè)階段，首先是出生后視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)延遲與現(xiàn)有血管部分消退，其次是缺氧誘導(dǎo)的病理性視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)生成[1]。損傷的視網(wǎng)膜血管會(huì)使血管閉塞、視網(wǎng)膜缺血，破壞視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障，導(dǎo)致血管滲漏、新生血管進(jìn)入玻璃體腔，引起視網(wǎng)膜脫離而失明[2]。盡管可以通過(guò)限制組織局部缺血(視網(wǎng)膜激光光凝術(shù))和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過(guò)度分泌(玻璃體腔注射抗VEGF藥物)的治療來(lái)預(yù)防RNV形成，但以上治療均有不同程度的限制性。視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)存在多種并發(fā)癥如視網(wǎng)膜出血、視功能不良等，抗VEGF藥物治療長(zhǎng)期療效和安全性也尚不確定，因此仍需深入了解ROP所涉及的機(jī)制，并開發(fā)新的治療方案[3-4]。

RNV的形成涉及兩種不同的機(jī)制，即血管發(fā)生和血管生成。前者是指由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)育成血管內(nèi)皮細(xì)胞并最終形成血管的過(guò)程；后者是指在原有的毛細(xì)血管或者微靜脈基礎(chǔ)上，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，以芽生或非芽生的形式生成新生的血管，大量研究證實(shí)眼部新生血管的形成具備上述兩種方式[5-6]。在血管發(fā)生的機(jī)制中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)發(fā)揮著重要的作用，本課題組前期研究表明BMSCs可被募集到缺氧的視網(wǎng)膜中并分化為如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型促進(jìn)眼部新生血管的形成[7-8]。然而缺氧條件下BMSCs是否也可通過(guò)血管生成的方式促進(jìn)RNV的形成及其潛在的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬采用體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型，利用BMSCs、猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，觀察缺氧條件下BMSCs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成能力的影響，豐富RNV的分子機(jī)制，為臨床診治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(雄性、4～6周齡)，購(gòu)自于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處死根據(jù)中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和ARVO規(guī)范進(jìn)行。RF/6A購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，HUVECs為自主培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)，DME/F12培養(yǎng)基(HyClone)，內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM，ScienCell)，孔徑8μm的Transwell小室(Millipore)，Matrigel基質(zhì)膠(BD)。

1.2方法

1.2.1 BMSCs的培養(yǎng)與鑒定BMSCs采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)。取4～6周齡C57BL/6J雄性小鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒，于超凈臺(tái)中取其股骨和脛骨，將骨髓沖洗到含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DME/F12培養(yǎng)基中，過(guò)濾并鋪在培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞在37℃下于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d更換1次培養(yǎng)基，直至達(dá)到80%～90%融合度后傳代。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs懸浮于PBS中，并將密度調(diào)節(jié)至每45μL PBS含細(xì)胞1×106個(gè)。細(xì)胞分為五管，其中一管用作陰性對(duì)照，其他管中分別加入PE-CD90、PE-CD44、FITC-CD34和FITC-CD45抗體，室溫孵育1h后將細(xì)胞重懸于PBS中并通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.2 HUVECs和RF/6A的培養(yǎng)HUVECs取材于空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，從新鮮臍帶中分離。將細(xì)胞在含有5% FBS、1%青霉素/鏈霉素和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑的ECM專用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，第3～6代用于研究。RF/6A在含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 BMSCs缺氧模型的建立和條件培養(yǎng)基的制備采用三氣培養(yǎng)箱模擬物理缺氧條件。BMSCs換液后置于37℃體積分?jǐn)?shù)為1% O2、5% CO2、94% N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)24h。取缺氧條件下培養(yǎng)的BMSCs培養(yǎng)基作為缺氧組的條件培養(yǎng)基(conditional medium，CM)、同時(shí)取常氧條件下培養(yǎng)的BMSCs培養(yǎng)基作為常氧組的CM、血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常培養(yǎng)基作為對(duì)照組的CM。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)采用24孔Transwell小室(8μm)進(jìn)行遷移測(cè)定。將RF/6A(2×104/孔)和HUVECs(1×105/孔)的細(xì)胞懸浮液分別接種到Transwell上室中，并將500μL不同組的CM添加到下室，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。然后將小室置于4%多聚甲醛中20min，小心擦拭小室上腔未遷移的細(xì)胞，繼續(xù)將小室用結(jié)晶紫染色15min。PBS洗3次后在顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.5管腔形成實(shí)驗(yàn)Matrigel基質(zhì)膠于4℃冰箱中過(guò)夜消融，1∶1稀釋后加入96孔板(50μL/孔)，37℃靜置30min使膠凝固。將RF/6A和HUVECs消化成懸液，每孔加入5×104個(gè)細(xì)胞，再用超濾后的對(duì)照組CM、常氧條件下BMSCs的CM和缺氧條件下BMSCs的CM補(bǔ)足至200μL，混勻后常規(guī)培養(yǎng)6h。顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果如上提取BMSCs，第3d首次換液后有少許短棒狀的細(xì)胞貼壁，第6d可見緊密排列、長(zhǎng)梭狀的細(xì)胞(圖1A，B)。首次傳代后，細(xì)胞狀態(tài)良好，呈多觸角狀生長(zhǎng)，第3代細(xì)胞大部分大小相似、呈成纖維狀、多觸角貼壁(圖1C，D)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行流式，鑒定其特異性表面抗原標(biāo)志物。結(jié)果顯示CD90和CD44呈陽(yáng)性(圖1E，F(xiàn))，CD34和CD45呈陰性(圖1G，H)，證明成功培養(yǎng)了BMSCs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2缺氧條件下BMSCs的CM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響采用Transwell方法檢測(cè)常氧和缺氧條件下的BMSCs對(duì)RF/6A遷移的影響。結(jié)果顯示，對(duì)照組、常氧組和缺氧組的血管內(nèi)皮遷移數(shù)量分別為19.00±3.61、32.33±3.06、114.00±11.53個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=153.3，P<0.001)。相對(duì)于對(duì)照組，常氧組和缺氧組的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量在24h后均有增加，缺氧組的遷移數(shù)量最多(均P<0.01，圖2)。同樣分組和方法檢測(cè)常氧和缺氧條件下的BMSCs對(duì)HUVECs遷移的影響，結(jié)果與RF/6A相似，對(duì)照組、常氧組和缺氧組的HUVECs遷移數(shù)量分別為76.00±9.54、122.00±18.68、307.70±25.97個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.5，P<0.001)，缺氧組處理的HUVECs遷移數(shù)量大于對(duì)照組和常氧組(均P<0.05，圖3)。

圖1 BMSCs的形態(tài)觀察和鑒定(×200)A：第3d少許細(xì)胞貼壁；B：第6d細(xì)胞呈緊密排列、長(zhǎng)梭狀；C：第1代細(xì)胞呈多觸角狀生長(zhǎng)；D：第3代細(xì)胞呈成纖維狀、多觸角貼壁生長(zhǎng)；E～H：流式鑒定BMSCs表面標(biāo)記物CD90、CD44陽(yáng)性，CD34和CD45陰性(E：CD90；F：CD40；G：CD34；H：CD45)。

圖2 Transwell檢測(cè)不同組細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用24h對(duì)RF/6A的遷移能力(×200)A：對(duì)照組；B：常氧組；C：缺氧組；D：遷移數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；bP<0.01 vs常氧組；dP<0.001 vs缺氧組。

圖3 Transwell檢測(cè)不同組細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用24h對(duì)HUVECs的遷移能力(×200)A：對(duì)照組；B：常氧組；C：缺氧組；D：遷移數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；aP<0.05 vs 常氧組；dP<0.001 vs缺氧組。

2.3缺氧條件下BMSCs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響RF/6A經(jīng)各組CM孵育6h后，對(duì)照組、常氧組和缺氧組的血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管數(shù)目、成管總長(zhǎng)度和分支數(shù)如下：(1)成管數(shù)目：12.00±3.00、37.00±4.58、51.00±3.61個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.7，P<0.001)；(2)成管總長(zhǎng)度：17.41×103±1.45×103、21.48×103±1.20×103、33.68×103±2.08×103μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.1，P<0.001)；(3)分支數(shù)：120.70±6.02、165.70±10.69、214.30±14.57個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.41，P<0.001)。結(jié)果顯示缺氧組的管腔形成能力明顯上升，其成管數(shù)目、成管總長(zhǎng)度和分支數(shù)均大于對(duì)照組和常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖4)。用相同刺激和方法處理HUVECs，各組成管數(shù)目、成管總長(zhǎng)度及分支數(shù)如下：(1)成管數(shù)目：2.00±1.00、6.67±1.53、30.0±03.61個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=124.0，P<0.001)；(2)成管總長(zhǎng)度：8.55×103±1.58×103、13.15×103±0.66×103、18.64×103±1.63×103μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.12，P=0.0003)；(3)分支數(shù)：83.00±7.21、120.70±4.04、147.70±12.86個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.63，P=0.0003)。結(jié)果也顯示相對(duì)于對(duì)照組和常氧組，缺氧組的管腔形成能力顯著增加(均P<0.05，圖5)，同RF/6A類似。

圖4 管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用6h對(duì)RF/6A的成管能力(×200)A：對(duì)照組；B：常氧組；C：缺氧組；D：成管數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖(bP<0.01,dP<0.001 vs 缺氧組)；E：成管總長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖(aP<0.05,bP<0.001 vs 對(duì)照組;dP<0.01 vs 常氧組)；F：分支數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(bP<0.01 vs 常氧組;dP<0.001 vs 缺氧組)。

圖5 管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用6h對(duì)HUVECs的成管能力(×200)A：對(duì)照組；B：常氧組；C：缺氧組；D：成管數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖(aP<0.05 vs 對(duì)照組;dP<0.001 vs 缺氧組)；E：成管總長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖(bP<0.01 vs 缺氧組;dP<0.01 vs 常氧組)；F：分支數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(aP<0.05 vs 缺氧組;dP<0.01 vs 對(duì)照組)。

3 討論

ROP患者出生后暴露于高氧環(huán)境時(shí)，由于缺乏健康血管發(fā)育所必需的因素，發(fā)生氧化應(yīng)激、氧調(diào)節(jié)的促血管生成因子的下調(diào)和促炎因子的上調(diào)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管閉塞，當(dāng)返回常氧條件時(shí)，形成由缺氧代償?shù)牟±硇孕律躘9]。BMSCs是骨髓來(lái)源細(xì)胞的一種重要類型，本組前期研究和文獻(xiàn)表明，BMSCs可以被募集到缺氧的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中，通過(guò)與新生的血管芽結(jié)合或者向血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的分化促進(jìn)眼部新生血管的形成[7,10-11]。Hou等[7]將BMSCs移植到激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs可分化為上述多種細(xì)胞類型促進(jìn)新生血管的形成。Cai等[11]也發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠CNV中，BMSCs可被募集到CNV中且VEGF和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)等表達(dá)上調(diào)。而缺氧條件下的BMSCs對(duì)RNV的研究較少，因此需要深入探討。

本研究采用常氧和缺氧條件下BMSCs的CM處理兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A和HUVECs，觀察其對(duì)RNV的影響。RF/6A是視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的組合細(xì)胞，為視網(wǎng)膜的特異性細(xì)胞系；HUVECs是從人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中分離的原代細(xì)胞，為研究新生血管的進(jìn)展提供了重要的體外血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，在視網(wǎng)膜新生血管的研究中也廣泛應(yīng)用[12-13]。本研究結(jié)果表明，在兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞中，相對(duì)于對(duì)照組和常氧組，缺氧組的CM能明顯提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成能力，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)量增多；成管數(shù)目、成管總長(zhǎng)度和分支數(shù)目增多。查閱文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，也有報(bào)道將缺氧條件下的BMSCs與HUVECs共培養(yǎng)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成情況，而除了骨髓來(lái)源的MSCs外，胎盤來(lái)源的MSCs與HUVECs共培養(yǎng)后，隨著缺氧水平的增加，HUVECs管狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和促血管生成因子的表達(dá)水平也相應(yīng)增加，這與我們的研究相似[14-15]。而本研究結(jié)果不僅證實(shí)在來(lái)源于臍帶較大血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中，在代表RNV病理生理學(xué)部位的毛細(xì)血管脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A中，缺氧條件下的BMSCs也具有提高血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的能力。

綜上所述，本研究證明，缺氧條件下的BMSCs可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs和RF/6A的遷移和血管形成能力，為BMSCs參與RNV性疾病的發(fā)生發(fā)展提供了體外理論支持。但缺氧條件下的BMSCs是如何調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的呢，其涉及的分子機(jī)制是什么呢？近期有研究證實(shí)，缺氧條件下BMSCs來(lái)源的外泌體及其含有的遺傳物質(zhì)，如信使RNA(mRNA)和micro-RNA(miRNA)，可促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和血管生成情況，外泌體中的遺傳物質(zhì)在細(xì)胞通訊中起重要作用，其可在生理和病理情況下由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外，參與病理性血管生成、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、炎癥和腫瘤的過(guò)程[16-17]。而缺氧條件下的BMSCs 是否也可以通過(guò)外泌體及其含有的miRNA調(diào)控RNV呢，這有待于我們進(jìn)一步去研究，通過(guò)體外到體內(nèi)研究及潛在的分子機(jī)制，再回到臨床層面的研究，有助于全面、深入地了解RNV性疾病的發(fā)生機(jī)制，為相關(guān)靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和可能的新藥開發(fā)提供重要的依據(jù)。