余曉宏 劉嶼 曾蓮 楊艷玲 王洲 李衛(wèi)

1.云南省第二人民醫(yī)院口腔內科 昆明 650012；2.昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科 昆明 650031

牙周炎等牙周組織疾病造成牙周支持組織的破壞，牙周附著的喪失，最終導致牙齒的松動、脫落。牙周炎治療的最終目的不但要控制炎癥和阻止病變的進一步發(fā)展，而且還要形成新的牙槽骨和牙骨質[1]。牙周膜干細胞分化是骨組織再生和修復的關鍵，因此研究牙周膜干細胞成骨分化的分子機制對于臨床上治療牙周組織疾病具有重要作用。

人牙周膜包圍干細胞亞群，其負責維持和再生牙周組織結構和功能。這些細胞表現出多能性，可以分化為成骨細胞、成纖維細胞和牙齒成牙骨質細胞，以及形成牙骨質和牙周膜樣組織，因此通常被稱為牙周膜干細胞，大量的動物研究[2]提供了可靠的證據支持牙周膜干細胞可用于牙周組織再生的設想。因此牙周組織再生治療的一個關鍵因素為促干細胞定向誘導分化，目前雖已證實骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉化生長因子、血小板衍生因子、雌激素等具有明確的骨向誘導作用。但對于牙周組織的修復治療仍需積極尋求更多的高效藥物。

由豬胎兒的牙齒材料[3]制備的釉基質衍生物（enamel matrix derivative）由疏水性蛋白質的混合物組成，其中牙釉蛋白含量超過90%。在牙周骨內缺損的治療中，釉基質衍生物被證明可以支持骨缺損的再生[4]。有研究[5-6]已經特別報道了釉基質衍生物可以在體外刺激成骨細胞和成牙骨質細胞的增殖和分化，并促進體內牙骨質和牙周組織的再生。在體外，釉基質衍生物能促進CD4+T細胞凋亡，抑制腫瘤壞死因子誘導的MC3T3-E1成骨細胞的凋亡[7]。另有研究[8]表明，將釉基質衍生物放入猴牙周缺損模型中，觀察到幾乎完全的無細胞牙骨質修復，膠原組織緊密地結合于新生的牙槽骨。雖然研究已經發(fā)現了釉基質衍生物有促進牙周膜成纖維細胞增殖及牙槽骨修復的作用，但其中的調控作用機制還很不明確，其對牙周膜干細胞的作用還有待進一步研究。人牙周膜干細胞成骨分化受到多種信號轉導通路的調節(jié)，如Wnt通路、Smad蛋白通路、p38有絲分裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路、Notch等[9]。Wnt信號通路已被證明在間充質干細胞增殖、分化、凋亡等過程均產生調控作用[10-11]，而Wnt信號通路是否參與調控釉基質衍生物促進人牙周膜干細胞成骨向分化尚無報道。因此本實驗旨在探討Wnt信號通路在釉基質衍生物促進人牙周膜干細胞成骨分化過程中是否起作用，從而進一步闡明釉基質衍生物促進人牙周膜干細胞成骨分化的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

釉基質衍生物（Straumann公司，瑞士），DDK1（Sigma公司，美國），Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（Gibco公司，美國）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）、青鏈霉素（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；Ⅰ型膠原，骨鈣素，β-連環(huán)蛋白，RunX2，CaMKⅡ及NLK引物合成（上海生工生物工程有限公司），Trizol提取試劑（Invitrogen公司，美國）；Super TaqMan OneStep RT-qPCR Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）；CCK-8檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）； β-連環(huán)蛋白抗體（Abcam公司，英國）、RunX2抗體（Santa Cruz Biochemistry公司，美國），CaMKⅡ（Abcam公司，英國）、NLK抗體（Abcam公司，英國），對應二抗（北京康為世紀生物科技有限公司）；STRO-1（Abcam公司，英國）、CD146流式抗體（Abcam公司，英國）；Masson Trichrome染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、Von Kosa’s染液（北京索萊寶科技有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（FORMA 3131；Thermo公司，美國），倒置相差顯微鏡（TS100；Nikon公司，日本），多功能酶標儀（FC；Thermo公司，美國），超低溫冰箱-80 ℃（L93-12L；Thermo公司，美國），低溫高速離心機（GS-15R；Beckman公司，美國），其余細胞培養(yǎng)耗材（Corning公司，美國），實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（ABI-7500；ABI公司，美國），低溫離心機（CF-16RX；日立公司，日本），流式細胞儀（CyFlow Space，Partec GmbH公司，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙周膜干細胞體外培養(yǎng)和鑒定 取因正畸而拔除的健康前磨牙，患者年齡11～14歲。用尖刀刮取牙根部的牙周膜組織，將組織剪成1 mm3碎塊。在超凈工作臺內用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）和不含胎牛血清的α-基礎Eagle’s 培養(yǎng)基（α-minimum Eagle’s medium，α-MEM）各清洗標本2次，將標本接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入適量含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM，置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后擴大培養(yǎng)。

選取生長狀況良好的第3代細胞，收集細胞后制備成單細胞懸浮液。向流式管中加入50 μL細胞懸浮液，使每管細胞數目約為106，向管中分別加入50 μL稀釋后的STRO-1、CD146單克隆抗體，并輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；然后用洗滌緩沖液洗滌細胞2次。每管加入250 μL緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀檢測。

1.2.2 CCK-8檢測釉基質衍生物對人牙周膜干細胞增殖的影響 收集對數生長期的細胞，用完全培養(yǎng)基重懸，將細胞接種于96孔板中，使每孔細胞數目為1×103，培養(yǎng)基體積為200 μL，調零孔只加入200 μL培養(yǎng)基。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，按實驗分組更換相應培養(yǎng)液，使釉基質衍生物的終濃度為10、20、50、100 mg·L-1，空白對照組不處理，分別于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d后取出1塊板。向每個孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（A）值，并計算細胞活力：

1.2.3 人牙周膜干細胞膠原合成及礦化結節(jié)形成檢測 取第3代人牙周膜干細胞，以5×104mL-1接種1 mL至24孔板，培養(yǎng)24 h后，每組3孔重復，對照組換成含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM，實驗組在相同的培養(yǎng)液中加入不同質量濃度的釉基質衍生物（20、50或100 mg·L-1），空白對照組不做處理，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、4周后進行以下檢測。

Trichrome染色檢測膠原合成情況：按試劑說明書進行，細胞用體積分數10%甲醛固定后，加入Bouin’s溶液56 ℃ 1 h，放入魏格特鐵蘇木精染液10 min，清洗后，放入比布列西酸性品紅液10～15 min，再放入苯胺藍溶液10 min，清洗后放入1%乙酸5 min，脫水后顯微鏡觀察。

茜素紅染色法檢測礦化結節(jié)形成情況：接種等量人牙周膜干細胞至24孔爬片，待細胞融合度達80%時，分別換液為含20、50、100 mg·L-1釉基質衍生物的DMEM，空白對照組換等體積不含釉基質衍生物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2、4周后，用茜素紅染色法將礦化結節(jié)染成紅色。將固定后的細胞爬片用PBS洗滌后，浸入5%硝酸銀水溶液中10 min，日光下放置暴曬30 min，蒸餾水洗滌，乙醇系列脫水，二甲苯透明，顯微鏡觀察。

1.2.4 qRT-PCR檢測成骨分化標志物mRNA水平收集生長狀況良好的第3代細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，qRT-PCR檢測成骨分化相關因子Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin）、RunX2 mRNA水平的表達情況。引物序列見表1。PCR程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃10 min。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2.5 Western blot、qRT-PCR檢測DDK1對人牙周膜干細胞成骨分化的影響 選取第3代人牙周膜干細胞，以5×104mL-1接種1 mL至6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM 2 mL，待細胞融合度達80%時，分別換液為含20、50、100 mg·L-1釉基質衍生物的DMEM和含0.05 mg·mL-1DKK1的DMEM，空白對照組換等體積DMEM，共5組，每組6孔重復。培養(yǎng)7 d后，其中3孔提取總RNA，經qRT-PCR檢測β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK在mRNA水平的表達情況；另外3孔提取總蛋白質，經Western blot檢測β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK在蛋白質水平的表達情況。

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，每個體外實驗至少進行3次。實驗數據均以均數±標準差表示；采用單因素方差分析檢驗差異顯著性，用LSD-t檢驗比較兩組間差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人牙周膜干細胞流式鑒定

采用組織塊消化培養(yǎng)的原代細胞，5～10 d可見組織塊周圍明顯有原代細胞爬出（圖1A），進一步通過有限稀釋克隆法得到純化的人牙周膜干細胞。純化后的人牙周膜干細胞形態(tài)豐滿，呈長梭形，細胞核聚集在中心，細胞呈反射狀、旋渦狀生長，2周左右即可達80%匯合（圖1B）；流式細胞檢測結果顯示第3代人牙周膜干細胞陽性表達間充質細胞表面標記物CD146（陽性）、STRO-1（陽性），證實所取得細胞為間充質來源（圖2）。

圖1 人牙周膜干細胞形態(tài)特征Fig 1 Morphological characteristics of human periodontal ligament stem cells

圖2 流式細胞儀檢測人牙周膜干細胞表面抗原的表達Fig 2 Flow cytometry detection of surface antigens of human periodonatal ligament stem cells

2.2 釉基質衍生物對人牙周膜干細胞活力的影響

CCK8檢測不同濃度（10、20、50、100 mg·L-1）釉基質衍生物對人牙周膜干細胞活力的影響，結果顯示（圖3），與空白對照組相比，在20 mg·L-1以上釉基質衍生物均明顯促進人牙周膜干細胞的活力，并呈現劑量和時間依賴性，在作用3 d后效果最明顯（P＜0.05）。

2.3 釉基質衍生物對人牙周膜干細胞成骨相關基因表達的影響

以釉基質衍生物（0、20、50、100 mg·L-1）分別培養(yǎng)牙周膜干細胞2、4周后，以qRT-PCR檢測成骨相關因子Ⅰ型膠原、骨鈣素、RunX2的mRNA表達水平。結果顯示，隨時間的延長，釉基質衍生物促進牙周膜干細胞成骨相關因子Ⅰ型 膠原、骨鈣素、RunX2表達（P＜0.05）（圖4）。

圖3 釉基質衍生物對牙周膜干細胞活力的影響Fig 3 Effects of enamel matrix derivatives on proliferation of periodontal ligament stem cells

圖4 qRT-PCR檢測牙周膜干細胞成骨相關基因表達Fig 4 Expression of osteogensis-related genes of periodontal ligament stem cells detected by qRT-PCR

2.4 釉基質衍生物對人牙周膜干細胞膠原合成及礦化能力的影響

以不同濃度的釉基質衍生物（0、20、50、100 mg·L-1）作用牙周膜干細胞2、4周后，檢測牙周膜干細胞生成膠原情況以及礦化結節(jié)形成情況；Trichrome染色結果顯示（圖5A～H），隨著釉基質衍生物的濃度越高，牙周膜干細胞合成膠原量顯著增多（P＜0.05），且呈劑量、時間效應關系，說明釉基質衍生物能夠促進牙周膜干細胞膠原的合成能力；茜素紅染色結果顯示（圖5I～P），隨著釉基質衍生物的濃度越高，牙周膜干細胞礦化結節(jié)形成量越多（P＜0.05），并且呈劑量、時間效應關系，說明釉基質衍生物能夠促進牙周膜干細胞礦化結節(jié)形成的能力。

2.5 Wnt信號通路在不同濃度釉基質衍生物作用下對人牙周膜干細胞成骨分化的影響

使用釉基質衍生物（20、50、100 mg·L-1）或0.05 mg·L-1DDK1分別培養(yǎng)牙周膜干細胞7 d后，以qRT-PCR和Western blot檢測β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達。結果顯示，在mRNA水平（圖6A～D），釉基質衍生物促進牙周膜干細胞RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達，而降低β-連環(huán)蛋白表達，并且呈現出一定劑量依賴效應（P＜0.05）；在蛋白質水平（圖6E）與mRNA表達一致，而當人牙周膜干細胞經DDK1處理后，釉基質衍生物的效果被明顯抑制。

圖5 Trichrome和茜素紅染色檢測牙周膜干細胞膠原合成和礦化能力Fig 5 Collagen synthesis and mineralization nodule formation of periodontal ligament stem cells detected by Trichrome staining and alizarin red staining

3 討論

目前針對牙周組織疾病治療的難點和重點都在于如何有效提升牙槽骨再生的水平。 Seo等[10]于2004年首次從人第三磨牙中分離出牙周膜干細胞，在一定的培養(yǎng)條件下，牙周膜干細胞能夠分化為成牙骨質細胞、脂肪細胞和膠原形成細胞。牙槽骨再生需要細胞同時具備較強的礦化能力和膠原合成能力，牙周膜干細胞移植可以是牙槽骨再生的有效方法[11]。

Wnt信號通路分為經典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路和非經典的Wnt/CaMKⅡ/NLK信號通路。目前在干細胞參與成骨分化的過程中研究較多的為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，但是對Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在人牙周膜干細胞的成骨分化過程中的作用尚有爭議[12-13]，有分析稱Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路對人牙周膜干細胞成骨分化的抑制或促進作用可能與細胞生長微環(huán)境、生長狀態(tài)和所受刺激等因素有關。

圖6 qRT-PCR和Western blot檢測牙周膜干細胞β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達Fig 6 Expression of β-catenin, RunX2, CaMKⅡ and NLK in periodontal ligament stem cells detected by qRT-PCR and Western blot

牙釉質基質蛋白是牙齒發(fā)育期間產生的以牙釉蛋白衍生蛋白為主的異質混合物。熱處理形式的牙釉質基質蛋白具有調節(jié)人牙周膜細胞的間充質和非間充質分化途徑的能力[14]，但由于從人牙胚不易獲得牙釉質基質蛋白，臨床上常用的釉基質衍生物是由豬牙胚中提取得到的釉基質蛋白純化獲得。牙釉質基質蛋白相對容易獲得，因此對于釉基質衍生物調節(jié)牙周膜干細胞的成骨分化將有助于進一步理解其發(fā)揮臨床療效的作用機制，對于釉基質衍生物的廣泛臨床應用顯得意義重大，同時能夠為牙周組織缺損的診療提供一定參考。

本實驗分離出牙周膜干細胞，并提供流式細胞儀鑒定，證明了牙周膜干細胞的干細胞特性。在給予濃度梯度的釉基質衍生物刺激后，細胞增殖能力得到顯著提高，同時細胞膠原形成和礦化能力以及成骨細胞相關基因表達也被明顯增強，提示釉基質衍生物能夠促進牙周膜干細胞的增殖，還能夠明顯促進其成骨分化，其結論與王爽等[15]的發(fā)現一致；另外，在濃度梯度釉基質衍生物作用的同時施加DKK-1，結果顯示牙周膜干細胞成骨分化能力被明顯抑制，表明抑制Wnt信號通路可抑制釉基質衍生物促進牙周膜干細胞成骨分化的能力，進一步表明釉基質衍生物促進牙周膜干細胞分化的作用可能是通過對經典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活，從而使糖原合成酶激酶（glycogen synthetase kinase，GSK）-3β大量被磷酸化，促進β-連環(huán)蛋白在細胞內聚集，并轉移至細胞核內與轉錄因子/淋巴增強因子結合，同時促進下游一系列靶基因的表達，調控了牙周膜干細胞的增殖與分化過程。另一方面，本研究還發(fā)現釉基質衍生物能促進CaMKⅡ、NLK表達，且其表達也與牙周膜干細胞成骨分化程度呈正相關，DDK-1作用后，CaMKⅡ、NLK表達被明顯抑制。提示，釉基質衍生物對牙周膜干細胞成骨分化的促進作用也可能涉及非經典的Wnt/CaMKⅡ/NLK信號通路。因此，本研究將有助于進一步明確釉基質衍生物促牙周膜干細胞分化的相關機制，對釉基質衍生物應用于臨床治療牙槽骨再生將能夠提供一定理論參考。但由于釉基質衍生物包含多種蛋白質，具體是哪些蛋白質或者哪種蛋白質的某一肽段發(fā)揮作用還需要進一步研究。