黃璐 戴杰 吳燕岷

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔內(nèi)科 杭州 310009；2.杭州市大江東醫(yī)院口腔科 杭州 311225；3.臺州醫(yī)院路橋院區(qū)口腔科 臺州 318050

口腔癌是一種頭頸癌，是一個嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題，屬于人類最常見的惡性腫瘤，5年死亡率約為50%，其中最為常見的是口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma）[1]?？谇话┑拇婊盥嗜Q于準(zhǔn)確的部位和確診時的癌癥分期。2011年SEER數(shù)據(jù)庫顯示，在考慮初始診斷階段、性別、種族、年齡組和治療方式的情況下，口腔癌患者的5年存活率約為57%，其中T1期癌癥患者的生存率大約能達到90%。因此，強調(diào)早期發(fā)現(xiàn)以提高患者的生存率，但是各種原因往往導(dǎo)致患者確診時已經(jīng)處于癌癥晚期（T3～T4期）[2-3]，嚴(yán)重影響了口腔癌的預(yù)后。

目前應(yīng)用于口腔癌檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法仍然是全面的臨床檢查、昂貴的生化檢測和具有侵入性的活組織檢查，所以尋找從生物體液（血液、尿液、唾液）中用于鑒定的生物標(biāo)志物具有早期診斷的潛在價值[4]。已有多項研究[5-6]證明唾液中含有的許多成分能夠反映患者在病理條件下的代謝水平；在唾液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種可能作為診斷口腔鱗狀細胞癌的潛在生物標(biāo)志物[7]。本文在簡單介紹口腔癌及唾液生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，回顧匯總了口腔鱗狀細胞癌相關(guān)領(lǐng)域的潛在唾液生物標(biāo)志物，從多個環(huán)節(jié)分析了研究中存在的一些問題與挑戰(zhàn)，對唾液生物標(biāo)志物在口腔鱗狀細胞癌領(lǐng)域的應(yīng)用價值及未來發(fā)展趨勢進行了探討。

1 唾液生物標(biāo)志物簡介

唾液是由唾液腺分泌液、齦溝液和黏膜滲出液等構(gòu)成的混合性液體，儲存了大量的人類口腔微生物和口腔局部組織以及身體其他部位感染微生物的DNA、RNA、蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物。另一方面，生物標(biāo)志物是正常生物學(xué)、病理學(xué)過程和對治療的藥理學(xué)反應(yīng)過程中變化的分子特征與指標(biāo)，可以為疾病的檢測、診斷和預(yù)后提供有用的信息。唾液是一種生物標(biāo)志物檢測的理想診斷介質(zhì)，其取材具有不侵襲性、易于采集、攜帶方便、貯存與運輸成本低等優(yōu)點[8-9]。

唾液中蛋白質(zhì)含量較低，成份比血清簡單[10-11]。血液或血清中有大量的分子，這使得檢測低含量和相對隱蔽的生物標(biāo)志物變得困難。與血液不同的是，唾液中的生物標(biāo)志物被稀釋并易于獲取，可以使用高靈敏度的擴增技術(shù)進行檢測，比如酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、Luminex xMAP液相芯片技術(shù)[12]、承載著納米金屬顆粒的微流控芯片檢測技術(shù)[13]、電化學(xué)磁珠生物傳感器[14]。這些特性使唾液成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的理想生物液體[15-16]。此外，口腔癌和口咽癌與唾液的直接接觸使唾液成為檢測這些癌癥類型的高特異性的、高靈敏性的潛在篩查工具。

2 有關(guān)口腔癌及癌前篩查中潛在唾液生物標(biāo)志物的研究進展

在口腔癌和癌前病變的診斷和檢測方面，關(guān)于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究很多。目前已有多種基于唾液的生物標(biāo)志物被用于早期發(fā)現(xiàn)口腔癌及癌前篩查[4,17-61]。從1992年底到現(xiàn)在，已有超過100項研究發(fā)表了120多種潛在唾液生物標(biāo)志物（DNA、RNA、蛋白質(zhì)），包括細胞因子[白細胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等]、防御素-1、抑癌基因p53、角蛋白（Cyfra）21-1、組織多肽特異性抗原（tissue polypeptide specific antigen）、雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase）、亞精胺/精胺-N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（spermidine/spermine N1 acetyltransferase）、肌動蛋白（profilin）、絲切蛋白（cofilin）-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）等，這些被認為是口腔癌及癌前診斷的潛在生物標(biāo)志物。

為了對唾液生物標(biāo)志物在口腔癌及癌前篩查方面的研究進行回顧性分析，筆者在PubMed數(shù)據(jù)庫進行了文獻檢索，檢索詞包含：“saliva”、“salivary”、“biomarker”、“oral cancer”、“precancer”（檢索詞單獨或幾個配對進行檢索）；文獻發(fā)表時限設(shè)置為1995年1月至2018年6月。排除綜述、論述、技術(shù)類文章等非研究性論文之后，進一步對文獻標(biāo)題及摘要進行閱讀，去掉以下文獻：1）研究對象非人類；2）缺乏對照或患者群體；3）研究方法缺乏清晰描述。最終篩選出的文獻是通過比較人類正常對照組和口腔癌患病組來研究該領(lǐng)域的潛在唾液生物標(biāo)志物的研究型論文，共計61篇。

2.1 樣品的采集方法

在所有的61項研究中，有47項研究表明是對整個唾液和特定的腺體唾液都進行了分析；在分析未刺激和刺激后采集唾液之間，有42項研究選擇了刺激后收集唾液進行分析；39項研究考慮了在采樣前不同時期的口腔刺激，如飲食和口腔衛(wèi)生習(xí)慣；大多數(shù)研究收集唾液的時間是早上，但沒有提到準(zhǔn)確的收集時間。

2.2 樣品檢測前的處理方式

在唾液取樣后，通常采用離心去除固體成分（包括食物殘渣），但是不同研究采用的離心參數(shù)不同，包含以下方案：800g離心10 min、2 000g離心10 min、2 600g離心15 min、2 000 r·min-1離心5 min、14 000 r·min-1離心20 min等[4,17-61]，其中也有少數(shù)研究在不離心的情況下直接對整個唾液進行評估[56-57]。一般情況下，先冷凍樣品，在進行后續(xù)分析之前才取出離心，所以大多數(shù)有關(guān)唾液生物標(biāo)志物的研究只分析了唾液樣本中不包含細胞的部分，但是唾液中70%的DNA來自于口腔黏膜細胞，離心處理導(dǎo)致了一些潛在生物標(biāo)志物的遺漏。另外，少數(shù)研究會使用RNA酶或蛋白酶抑制劑來減少唾液RNA和蛋白質(zhì)的降解[49,58-59]；大多數(shù)研究中并沒有添加任何抑制劑，都是直接離心后將上清樣品儲存在-80～4 ℃環(huán)境中[40]，但是信使RNA（messenger RNA，mRNA）性質(zhì)特別不穩(wěn)定，在幾分鐘內(nèi)就可以完全降解；僅有3項研究是立即分析樣本。

2.3 樣品的檢測方法

在唾液生物標(biāo)志物的檢測方面，常見的檢測技術(shù)有二維凝膠電泳、ELISA、Luminex xMAP液相芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)定量（Western blot）、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）等。因為每項研究采用的檢測方法都不一致，不同研究相同標(biāo)志物的水平差異較大，無法進行對比。為了加快唾液生物標(biāo)志物在臨床上的使用，很有必要對其樣品的采集、儲存及分析等進行規(guī)范化，在此基礎(chǔ)上通過不同的基礎(chǔ)研究找出潛在的唾液生物標(biāo)志物，最終應(yīng)用于臨床測試。

2.4 研究對象的選擇

大多數(shù)的研究在選擇患者時并沒有特定的選擇標(biāo)準(zhǔn)，僅僅是將收集到的所有患者及正常人進行匯總，在此基礎(chǔ)上得到的結(jié)果往往可靠性相對不強，建議在選取研究對象時，設(shè)定一個明確的篩選標(biāo)準(zhǔn)，比如年齡、性別、臨床表型程度等，盡量縮小組內(nèi)和組間的個體差異。本文對已報道的口腔癌及癌前診斷的唾液生物標(biāo)志物進行了整理（表1）。

續(xù)表1

續(xù)表1

2.5 其他因素對檢測結(jié)果的影響

口腔作為一種微環(huán)境，其外傷、牙菌斑、牙齦炎、牙周炎、真菌感染等疾病都會導(dǎo)致微生物、促炎細胞因子等的變化，在一定程度上會影響口腔癌和癌前病變的唾液生物標(biāo)志物水平。因此，為了驗證口腔癌特定唾液生物標(biāo)志物的可靠性，需要對具有普通非腫瘤性口腔炎性疾病的個體進行可能的唾液生物標(biāo)志物的研究。但是，在不考慮其他炎癥條件的情況下，建議盡可能根據(jù)唾液生物標(biāo)志物水平來診斷口腔癌、癌前病變。

許多潛在的口腔癌唾液生物標(biāo)志物，如8-羥基脫氧鳥苷和丙二醛在肺癌和乳腺癌等不同癌癥中也會發(fā)生改變[60-61]，說明多個唾液生物標(biāo)志物可能會因一種以上癌癥的存在而顯著改變，在這種情況下可以考慮唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測口腔癌，增加診斷結(jié)果的可靠性及特異性。然而，有關(guān)唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷口腔癌的研究很少，需要進一步的深入。已研究報道的多種唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測情況匯總見表1。

2.6 唾液微生物作為潛在生物標(biāo)志物的應(yīng)用價值

就唾液微生物種類而言，雖然已有研究證明正常人和口腔癌患者的微生物種類和數(shù)量存在差異，比如流感嗜血菌、棒桿菌、卟啉單胞菌、羅卡利馬氏體、芽孢桿菌等[47]。但是，微生物之間的差異受多種因素（比如年齡、性別等）綜合影響。因此，有關(guān)唾液微生物在口腔癌中應(yīng)用的研究還需要進一步深入，筆者認為將微生物作為潛在的生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價值不大。

2.7 應(yīng)用于口腔癌篩查所面對的問題與挑戰(zhàn)

從多個方面對檢索到的文獻進行統(tǒng)計分析后，筆者發(fā)現(xiàn)有關(guān)唾液生物標(biāo)志物在口腔癌及癌前篩查領(lǐng)域的研究尚處于早期階段，很多相關(guān)問題及挑戰(zhàn)亟待解決。例如：唾液樣本的采集、處理和儲存缺乏標(biāo)準(zhǔn)化；口腔癌、癌前和健康個體的潛在唾液生物標(biāo)志物水平存在廣泛的不一致性和不穩(wěn)定性，唾液生物標(biāo)志物的特異性及靈敏性有待進一步驗證；微小RNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA等[41-42]最新RNA領(lǐng)域研究相對空白，尚無可單獨用于口腔癌診斷的唾液指標(biāo)；需要標(biāo)準(zhǔn)化口腔唾液生物標(biāo)志物，以適應(yīng)不同的慢性口腔炎性疾病和其他類型的癌癥患者；為了排除其他癌癥對唾液生物標(biāo)志物水平的影響，提高口腔癌及癌前篩查的診斷效果，可以合理聯(lián)合檢測多種唾液生物標(biāo)志物。使唾液生物標(biāo)志物在臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)化的步驟可歸納為3步：1）唾液樣本采集、處理和分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化；2）明確非癌癥患者和癌癥患者中不同水平的唾液生物標(biāo)志物；3）唾液生物標(biāo)志物的確認。

3 唾液生物標(biāo)志物的未來展望

唾液易于采集、處理、儲存，且含有高質(zhì)量的DNA，是血液的完美替代品。唾液組學(xué)的研究對于識別疾病的高特異性及靈敏性生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點具有重要作用。唾液基因組學(xué)還具有遺傳篩查、早期疾病診斷的潛力。目前，唾液及其在疾病診斷中的應(yīng)用研究仍處于初級階段，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的方法和技術(shù)，這些研究的進展受到了限制，且相互之間可比性很低，因此急需開發(fā)一套唾液生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定系統(tǒng)。唾液組學(xué)的系統(tǒng)知識網(wǎng)絡(luò)和疾病的精確生物標(biāo)志物有助于更好地理解口腔健康和系統(tǒng)健康之間的關(guān)系，這將促進精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，促進精準(zhǔn)、無痛、方便的靶向治療的個性化。