孟 波，李曉宇，崔新玲，應(yīng)萬(wàn)濤*，錢(qián)小紅1，*

(1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京)，北京 102206；3.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100022)

蛋白質(zhì)糖基化修飾是最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Protein post-translational modification,PTM)之一[1]，根據(jù)其連接的氨基酸不同分為N-糖基化修飾和O-糖基化修飾兩種[2]，其中N-糖基化修飾在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)等方面起著重要的作用[3-4]，N-糖蛋白還是主要的腫瘤治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物來(lái)源，如前列腺癌中的前列腺特異性抗原 PSA[5]，卵巢癌中的腫瘤抗原CA125[6]，乳腺癌中的Her2/neu[7]和肝癌中的分子診斷標(biāo)志物AFP[8]。N-糖基化修飾一直是單克隆抗體藥物質(zhì)控、腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和臨床蛋白組學(xué)研究的熱點(diǎn)，但蛋白N-糖基化修飾微觀和宏觀的不均一性、樣本制備要求起始量高、糖鏈標(biāo)準(zhǔn)品缺少等原因，限制了糖組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用?，F(xiàn)階段，N-糖組學(xué)樣品制備的常規(guī)過(guò)程，需經(jīng)過(guò)蛋白的提取、變性、還原烷基化、蛋白消化、N-糖鏈的釋放及N-糖鏈的富集等多個(gè)步驟，容易造成糖鏈組分的損失。2014年Kulak等[9]研發(fā)了一種In-Stage Tip方法，用于在單個(gè)封閉空間內(nèi)中進(jìn)行蛋白樣品處理，該方法將樣品制備的多步驟合并成單一步驟用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，在一定程度上降低了蛋白樣品制備的起始量。2016年Chen等介紹了一種簡(jiǎn)單和集成的基于Spintip的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[10],該技術(shù)較過(guò)濾輔助樣品制備(Filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP)方法優(yōu)化了蛋白樣品制備的實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了肽段的梯度洗脫。雖然近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備方案有了很大的進(jìn)步，但是將這些方案用在N-糖鏈的樣本制備上仍缺乏系統(tǒng)研究。液相色譜法和質(zhì)譜法為目前常用的兩種N-糖鏈檢測(cè)技術(shù)。液相色譜法雖然可以很好地對(duì)N-糖鏈進(jìn)行檢測(cè)，但操作時(shí)間長(zhǎng)、N-糖鏈需求量高，需要大量的糖蛋白，在很多情況下難以獲取足夠的蛋白進(jìn)行N-糖鏈的樣品制備，特別是對(duì)于臨床上的微量體液標(biāo)本、病理切片、穿刺樣本等。因此，需要建立低損失的蛋白消化、N-糖鏈釋放和富集的一體化技術(shù)，結(jié)合快速靈敏的N-糖鏈分析方法以實(shí)現(xiàn)微量糖蛋白N-糖組分析。本研究嘗試建立了針對(duì)微量樣本的N-糖鏈制備技術(shù)(N-Glycan preparation technology,GPAT),用以降低N-糖組學(xué)研究的起始蛋白量。通過(guò)人免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2細(xì)胞蛋白，驗(yàn)證了GPAT對(duì)單純樣本和復(fù)雜樣本N-糖組分析的可行性，并進(jìn)一步將此方法應(yīng)用于6例健康人(3例男性，3例女性)的尿蛋白的N-糖組分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Ultraflex基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS，美國(guó)Bruker公司)；離心機(jī)和冷凍干燥離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；微型個(gè)人離心機(jī)-Multi Spin(日本TOMY公司)；JY 92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技公司)；親水相互作用色譜填料(HILIC)和反相色譜填料(C18)(天津博納艾杰爾科技公司)。

IgG標(biāo)準(zhǔn)蛋白、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯乙酰氨(CAA)、三氟乙酸(TFA)、肽-N-糖苷(PNGase F)、尿素(UA)(美國(guó)Sigma公司)；胰蛋白酶(Trypsin,測(cè)序級(jí))(美國(guó)Promega公司)；乙腈(ACN)(美國(guó)Merck公司)；2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)(美國(guó)Bruker公司)；Milli-Q去離子水制備系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；其它化學(xué)品均為分析純。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白提取

HepG2細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(DMEM)在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至直徑10 cm表面皿的80%時(shí)，胰蛋白酶消化回收細(xì)胞。然后，使用1×PBS對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌去除培養(yǎng)基，再加入1 mL 8 mol/L UA溶解在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)中重懸細(xì)胞,然后將其置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取：超聲功率200 W，工作1 s，間隙2 s，共99個(gè)循環(huán)。提取的蛋白應(yīng)用Bradford法測(cè)定濃度，最后按照所需的量分裝，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人尿蛋白的獲取

尿液樣本來(lái)自健康男性和女性各3例(年齡25～30歲)，均為空腹晨尿的中段尿，收集至離心管中，于4 ℃下12 000 g離心15 min。取上清液與預(yù)冷丙酮混合，于-20 ℃下過(guò)夜。將預(yù)冷過(guò)夜的混合物取出，在4 ℃下2 000 g離心5 min獲得蛋白沉淀，加入8 mol/L UA緩沖液復(fù)溶蛋白。蛋白用Bradford法測(cè)定濃度，最后按照所需的量分裝，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 GPAT樣品處理裝置和流程Fig.1 GPAT sample processing unit and proceduresreaction chamber A:digestion of proteins,release of N-glycans;reaction chamber B:enrichment of N-glycans

1.4 GPAT的設(shè)計(jì)及操作

如圖1所示，整個(gè)裝置由反應(yīng)室A和反應(yīng)室B組成，其制作成本低，制作時(shí)間短，在2～3 min內(nèi)即可制作完成整個(gè)裝置。反應(yīng)室A：在100 μL Tip尖端填一層篩板后引入C18填料，再在填料上方加一層篩板,依次使用純乙腈、50%ACN+0.1%TFA、0.1%TFA對(duì)其活化。反應(yīng)室A主要用于蛋白的還原、烷基化、酶解、切糖以及N-糖鏈的分離。反應(yīng)室B：在200 μL Tip尖端加載一層篩板，然后將HILIC填料引入Tip中,依次使用1%TFA、80%ACN+1%TFA對(duì)其活化。反應(yīng)室B主要用于N-糖鏈的富集。兩個(gè)反應(yīng)室活化過(guò)程中均使用Multi Spin除去液體。

GPAT操作流程：取10 μg 溶解于8 mol/L UA的蛋白加入到活化好的反應(yīng)室A中，同時(shí)加入由100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解的TCEP和CAA，終濃度分別為10 mmol/L和15 mmol/L,將其放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)1 h。待反應(yīng)完成后，加入適量100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)使反應(yīng)體系中尿素濃度低于2 mol/L,然后按蛋白∶酶=50 μg∶1 μg比例加入Trypsin酶，放入37 ℃恒溫箱中消化16 h。反應(yīng)完成后，按蛋白∶酶=20 μg∶1 U的比例加入PNGase F酶并在 37 ℃恒溫箱中切糖2 h。反應(yīng)完成后，加入TFA使體系終濃度為0.1%,離心收集酶切液。加入和酶切液等體積的0.1%TFA，2 000 g離心1 min，將N-糖鏈組分洗脫至反應(yīng)室B中，加入ACN和TFA使反應(yīng)室B體系變?yōu)?0%ACN+1%TFA,2 000 g離心 90 s使N-糖鏈與HILIC結(jié)合，加入80%ACN+1%TFA洗脫非糖鏈物質(zhì)。最后，加入0.1%TFA洗脫N-糖鏈，收集組分待測(cè)。

1.5 FASP樣本制備流程

1.5.2 N-糖鏈的富集用EP管稱取5 mg的HILIC填料，先用0.1%TFA活化填料3次，每次10 min；再用80%ACN+0.2%TFA溶液平衡填料3次，每次10 min。將熱干的含有N-糖鏈的樣品復(fù)溶于80%ACN+0.2%TFA溶液，并與填料混合，于室溫下旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h。然后轉(zhuǎn)入到自制富集小柱，3 000 g離心1 min。用80%ACN+0.2%TFA溶液再洗1次去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，最后用0.1%TFA洗脫3次，得到純化的N-糖鏈。參照2018年Zhang等[12]使用的酸法去除N-糖鏈的唾液酸。

1.6 MALDI-TOF MS分析

采用對(duì)MALDI-TOF MS對(duì)N-糖鏈樣品進(jìn)行分析。使用肽校準(zhǔn)品(Bruker)進(jìn)行外部校準(zhǔn)，選擇2,5-DHB作為基質(zhì)(用70%ACN+0.1%TFA溶解的1 mmol/L NaCl溶解配制，終濃度為20 mg/mL)，使用水溶解N-糖鏈樣本，取1 μL樣品點(diǎn)于潔凈的不銹鋼靶上，待自然干燥后取1 μL基質(zhì)點(diǎn)靶，待樣品與基質(zhì)自然結(jié)晶后推入離子源待測(cè)。所有樣品的激光強(qiáng)度保持恒定，累加1 500張譜圖，采用正離子反射模式對(duì)N-糖鏈進(jìn)行分析。MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)采用FlexAnalysis 3.3軟件進(jìn)行分析，糖型采用GlycoWorkbench 2.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 IgG N-糖組分析

圖2 10 μg IgG采用GPAT獲得的N-糖鏈的MALDI-TOF MS譜圖Fig.2 10 μg IgG N-glycan MALDI-TOF MS spectra obtained with GPAT the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled;the N-glycan structure simple map display method uses the Consortium for Fuctional Glyomics(CFG) standard to display the graphical rules;the symbols represent the following meanings:“”D-galactose；“”D-mannose；“”N-acetyl-D-glucosamine；“”L-fucose.

在基于質(zhì)譜的N-糖組分析中，通用的FASP樣品制備方案對(duì)于蛋白起始量要求很高，而N-糖鏈釋放前蛋白復(fù)雜的處理步驟,以及N-糖鏈富集前對(duì)N-糖鏈的熱干、重溶處理，不僅時(shí)間長(zhǎng)且會(huì)造成樣品的損失和污染。本研究致力于降低樣品制備的蛋白起始量，減少樣品制備時(shí)間，以滿足基于質(zhì)譜的快速、微量蛋白的N-糖組分析。還原劑TCEP和烷基化劑CAA相容，可以同時(shí)使用。因此，選用TCEP和CAA同時(shí)加入反應(yīng)體系中對(duì)蛋白進(jìn)行還原和烷基化處理，以達(dá)到簡(jiǎn)化操作步驟、縮短操作時(shí)間的目的。由于GPAT是在離心機(jī)上進(jìn)行，因此可以實(shí)現(xiàn)樣品的高通量分析。而對(duì)于N-糖鏈的富集,本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，使N-糖鏈洗脫和富集可以實(shí)現(xiàn)無(wú)縫銜接，減少了常規(guī)的N-糖鏈富集時(shí)間和操作步驟，降低了N-糖鏈的損失。

圖3 10 μg HepG2細(xì)胞提取蛋白采用GPAT方法制備N-糖鏈得到的MALDI-TOF MS譜圖Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans prepared by GPAT protocol for 10 μg HepG2 cell extracts R1,R2,and R3 are three replicate experiments,and the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled

IgG是分子量約為150 kDa的糖蛋白，分子為Y型，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中重鏈分為抗原結(jié)合區(qū)(Fab)和抗體結(jié)合區(qū)(Fc)。Fc段具有一個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)(含量約為3%～4%)，該位點(diǎn)的N-糖鏈修飾比較保守，因此，使用IgG驗(yàn)證GPAT對(duì)于單純蛋白N-糖鏈制備的可行性。由于唾液酸易帶負(fù)電，因此在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)會(huì)抑制N-糖鏈的信號(hào)甚至導(dǎo)致N-糖鏈無(wú)法檢出，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)所有N-糖鏈進(jìn)行了酸法去除唾液酸。采用GPAT和FASP方法對(duì)分別對(duì)IgG進(jìn)行N-糖組分析。采用GPAT分別對(duì)2、5、10、15、20 μg的 IgG進(jìn)行N-糖組分析，同時(shí)采用FASP方法分別對(duì)10、15、20、50、100 μg的IgG進(jìn)行N-糖組分析，得到兩種方法的IgG蛋白起始量分別為10、50 μg。如圖2所示，采用GPAT對(duì)10 μg IgG進(jìn)行N-糖組分析，獲得了20種N-糖鏈,這與用FASP方法以50 μg IgG為起始量得到的結(jié)果一致。由此，在得到相同N-糖組分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，GPAT方法所需要的蛋白起始量更低。

2.2 HepG2細(xì)胞提取蛋白的N-糖組分析

N-糖基化修飾在細(xì)胞、組織、分泌體系等蛋白中具有重要的功能性作用，因此研究這些蛋白樣本的N-糖組分布具有重要的意義。細(xì)胞、組織等樣本含有多種蛋白，蛋白成分復(fù)雜，這些復(fù)雜蛋白成分中也含有豐富的N-糖鏈信息。本研究以8mol/L UA提取人肝癌HepG2細(xì)胞系蛋白，并采用GPAT對(duì)其進(jìn)行N-糖組分析。首先，根據(jù)“2.1”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用10 μg HepG2細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行N-糖鏈的制備,并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，3次實(shí)驗(yàn)均鑒定到39種N-糖鏈。對(duì)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩兩進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，其相關(guān)系數(shù)r2=0.953～0.976，說(shuō)明方法具有很好的重復(fù)性。同時(shí)以2、5 μg蛋白為起始量采用GPAT方案制備N-糖鏈，MALDI-TOF MS分析結(jié)果均未得到N-糖鏈信號(hào)。

2.3 健康人尿蛋白N-糖組分析

尿液易于獲取，并且可以反映腎臟濾過(guò)蛋白質(zhì)的功能，因此，尿液是公認(rèn)的疾病診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)樣本理想來(lái)源[13-14]。尿液中可作為疾病診斷標(biāo)志物的多為微量蛋白，例如，健康人尿中微量白蛋白最低含量為20 μg/mL，因此,常用的FASP方法需要基于大量的尿液樣本來(lái)獲取尿蛋白N-糖鏈信息。本研究采用GPAT方法，對(duì)從6例健康人(3例男性，3例女性)的500 μL尿液里提取的10 μg蛋白進(jìn)行N-糖鏈制備。MALDI-TOF MS分析結(jié)果如圖5所示，在去除唾液酸異質(zhì)性的基礎(chǔ)上，男性和女性尿蛋白均鑒定到了49種N-糖鏈且結(jié)構(gòu)類型一致。如圖6所示，對(duì)3例男性和3例女性尿液樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析，組內(nèi)分析結(jié)果為女性r2=0.938～0.958,男性r2=0.948～0.964，說(shuō)明組內(nèi)3次生物學(xué)重復(fù)有很好的重現(xiàn)性。男性和女性組間皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果的平均r2=0.924。組間相關(guān)性小于組內(nèi)相關(guān)性，說(shuō)明N-糖鏈的相對(duì)豐度在男性和女性之間存在差異。對(duì)男性和女性尿蛋白N-糖鏈進(jìn)行定量分析，其結(jié)果如表1所示。男性和女性尿蛋白N-糖鏈中存在2種差異糖型，分別為HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)樣品例數(shù)較少，進(jìn)一步加大樣品例數(shù)后，將有望發(fā)現(xiàn)生理病理過(guò)程中相關(guān)的差異表達(dá)糖鏈信息。

圖6 3例男性和3例女性尿蛋白N-糖組分析結(jié)果進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析Fig.6 The results of 3 males and 3 females were analyzed by pearson correlation analysis F1,F2 and F3 represent 3 different healthy females,and M1,M2 and M3 represent 3 different healthy males(F1、F2、F3代表3例不同的健康女性，M1、M2、M3代表3例不同的健康男性)

3 結(jié) 論

通過(guò)GPAT技術(shù)對(duì)10 μg IgG和10 μg HepG 2細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行N-糖組分析，分別鑒定到20種和39種N-糖鏈，證明了GPAT適用于微量蛋白N-糖組分析。將GPAT技術(shù)應(yīng)用于健康人尿蛋白N-糖組分析，鑒定到49種N-糖鏈。同時(shí)對(duì)男性和女性鑒定到的各N-糖鏈進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)為差異顯著糖型。GPAT技術(shù)可以很好地應(yīng)用于微量蛋白的N-糖組分析，具有操作步驟更少、操作時(shí)間更短、樣本制備起始蛋白量更低，可以實(shí)現(xiàn)樣品高通量分析的優(yōu)點(diǎn)。但GPAT在分析含有唾液酸的N-糖鏈，適用于各種蛋白溶劑方面依然存在不足，在后續(xù)的研究中將進(jìn)行改善。

表1 尿蛋白N-糖鏈MALDI-TOF MS相對(duì)定量結(jié)果Table 1 Relative quantitative results of urinary protein N-glycans by MALDI-TOF MS

Hex(己糖)；HexNAc( N-乙酰己糖胺)；Fuc(L-巖藻糖)