尹 峰，楊冰潔，李 靖，李克靜，李淑娟

(中國檢驗檢疫研究院綜合檢測中心，北京 100123)

食品中氯丙醇脂肪酸酯的污染以3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-Chloro-1,2-propanediol fatty acid esters,3-MCPDEs)最為嚴重，國內(nèi)外對其在食品中的檢測技術(shù)研究報道亦最多，其水解產(chǎn)物3-氯-1,2-丙二醇(3-Chloro-1,2-propanediol,3-MCPD)對人體有很強的毒副作用[1]。2013年，國際癌癥研究機構(gòu)(International agency for research on cancer,IARC)將3-MCPD列為2B類致癌物，即可能對人有致癌作用。目前國際上尚無氯丙醇脂肪酸酯的限量標準，2017年糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives and Contaminants(FAO/WHO),JECFA)推薦3-MCPD當量(游離3-MCPD及3-MCPDEs總和)的每日耐受攝入量(Tolerable daily intake，TDI)為4 μg/kg體重/天[2]，2018年歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)推薦其TDI為2 μg/kg體重/天[3]。氯丙醇脂肪酸酯具有種類和結(jié)構(gòu)多樣性，其可由單氯取代的氯丙醇(Monochloropropanediol esters,MCPD)和雙氯取代的氯丙醇(Dichloropropanol esters,DCP)的任一個或兩個羥基與食品中天然存在的任何脂肪酸結(jié)合形成。雖然脂肪酸的種類相對豐富，但常僅需要考慮核心的6或7種[4]，在植物油中，棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、亞麻酸等與3-MCPD形成的12種對稱或不對稱二酯最廣泛存在[5]，且以3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯(3-MCPD-DP)的檢出率最高[6]，最高檢出含量可達0.5 mg/kg。

測定氯丙醇脂肪酸酯含量的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[7-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6,12-14]、超臨界流體色譜-質(zhì)譜法[15]、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[16]等。液相色譜-質(zhì)譜法可用于氯丙醇酯結(jié)構(gòu)類型、代謝動力學等的研究，與氣相色譜-質(zhì)譜法相結(jié)合，能更好的研究食品中氯丙醇酯的污染來源，控制此類污染物的遷移。目前液相色譜-質(zhì)譜法前處理主要采用硅膠柱與C18柱雙柱聯(lián)合凈化[5,13-14]，在實操上較繁瑣；或采用基質(zhì)輔助固相萃取凈化[6,12]，但在凈化效果方面存在不足。

EFSA報告[17]顯示動植物油脂中氯丙醇酯的污染較普遍，且以棕櫚油脂中的含量最高。本研究以植物油為樣本，以污染最普遍的3-MCPD-DP為研究對象，采用實驗室自填裝PSA+C18吸附劑的固相萃取柱凈化，有效減少了油脂對儀器的污染，獲得了一種操作簡便、靈敏度較高的可用于油脂中3-MCPD-DP檢測的固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。本方法可為建立油脂中其他氯丙醇酯類物質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法提供技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-LC/6460-MS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q 超純水機(美國 Millipore 公司)；PL303型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；SI VortexGenie2漩渦混合器(美國Scientific Industries公司)；12孔固相萃取裝置(美國Supelco公司);N1-05型氮吹濃縮儀(中國上海乞饒儀器公司)。

3-MCPD-DP、D5-3-MCPD-DP標準品(≥98.0%，加拿大Toronto公司)；甲醇、乙腈、正己烷、異丙醇(色譜級，美國Fisher公司)；甲酸銨(色譜級，美國Sigma公司)；C18、PSA吸附劑(美國Agilent公司)；實驗用水為 Milli Q超純水。

取適量3-MCPD-DP及D5-3-MCPD-DP標準品，用正己烷溶解，得到1 mg/mL 3-MCPD-DP及250 μg/mL D5-3-MCPD-DP標準溶液，置于-18 ℃下避光貯存。準確移取適量上述標準溶液，用乙腈-異丙醇(1∶1，體積比)溶液稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的系列混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

稱取油脂樣品0.100 g于10.0 mL比色管中，加入100 μL 1 μg/mL 的D5-3-MCPD-DP標準使用液，用乙腈-異丙醇(1∶1)溶液溶解定容。稱取PSA、C18吸附劑各500 mg，混勻后填充于帶篩板的固相萃取空管中。該固相萃取柱分別經(jīng)5 mL乙腈、異丙醇活化后，準確移取2.0 mL樣液于固相萃取柱中，濾液棄去，用4 mL乙腈-異丙醇(2∶8)溶液洗脫，40 ℃水浴下氮吹至干，甲醇定容至1 mL，0.22 μm尼龍濾膜過濾，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3 液相色譜條件

ThermoFisher Accucore C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；柱溫為45 ℃；流動相A為甲醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸銨)，流動相B為異丙醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸銨)；流速為0.3 mL/min；進樣體積為10 μL。梯度洗脫程序為0～9.0 min，0%B；9.0～9.5 min，0%～10%B；9.5～11.5 min，10%B；11.5～13.5 min，10%～100%B；13.5～15.5 min，100%B；15.5～16.0 min，100%～0%B；16.0～20.0 min，0%B。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源，正離子模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；氣流溫度：350 ℃；氣流速度：10 L/min；霧化氣壓力：241 kPa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：4 000 V；噴霧電壓：1 000 V；3-MCPD-DP的監(jiān)測離子對：604.5/330.6(定量離子對)和604.5/239.0，裂解電壓：80 V，碰撞能量分別為15 eV和12 eV；D5-3-MCPD-DP的監(jiān)測離子對：609.5/335.7，裂解電壓：70 V，碰撞能量：15 eV；加速器電壓：3 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 離子化條件的優(yōu)化氯丙醇酯在電噴霧離子源下不易形成[M+H]+，在銨鹽或鈉鹽存在時，可離子化為[M+NH4]+或[M+Na]+，但鈉鹽易造成質(zhì)譜儀的污染，不利于儀器的維護與使用[18]。本方法使用銨鹽考察3-MCPD-DP的離子化條件，當流動相中分別含2、5、10 mmol/L乙酸銨時，對1 μg/mL的3-MCPD-DP標準溶液在ESI源正/負離子模式下進行全掃描。結(jié)果顯示，在ESI(+)模式下，乙酸銨濃度為2 mmol/L和5 mmol/L時均得不到[M+NH4]+，在10 mmol/L時能得到穩(wěn)定的[M+NH4]+；而在ESI(-)模式下均得不到相應(yīng)的母離子。隨后在MRM模式下發(fā)現(xiàn)定量離子對604.5/330.6的峰面積在流動相中含10 mmol/L乙酸銨時較20 mmol/L乙酸銨時更強。進一步比較了定量離子對分別在10 mmol/L甲酸銨、乙酸銨下的峰面積，發(fā)現(xiàn)其在甲酸銨溶液中具有更高的響應(yīng)。最終確定以10mmol/L甲酸銨促進3-MCPD-DP在離子源中的離子化。

2.1.2 色譜柱的選擇考察了ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Capcell pak C18MGⅢ(2.0 mm×100 mm,3 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)5種不同反相色譜柱在“1.3”洗脫程序下對3-MCPD-DP 的分離效果。結(jié)果顯示，3-MCPD-DP在上述色譜柱上均能獲得較好的分離度，且雜質(zhì)峰的形狀和洗脫順序基本一致，但保留時間有較大差異，其中Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)與ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)保留時間基本一致，而其他3種色譜柱的保留時間延遲4～8 min，峰寬增加，且靈敏度降低。最后選擇ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)作為分析用色譜柱，以獲得較合適的保留時間、較低的系統(tǒng)壓力，且在流動相梯度上也更具選擇性。

2.1.3 流動相的優(yōu)化將基質(zhì)加標的橄欖油樣品(含 200 ng/mL 3-MCPD-DP)凈化后，與同濃度的溶劑標準溶液比較，上機考察二者的保留時間、峰面積、峰寬及絕對回收率等，以確定最佳的流動相洗脫條件。結(jié)果顯示，在C18色譜柱上，隨著保留時間的延長，溶劑標液的峰面積逐漸變大，之后保持一定水平,峰寬變寬。但相同條件下基質(zhì)加標樣品的絕對回收率不呈此趨勢，顯然基質(zhì)的存在影響了樣品中目標物的響應(yīng)。選擇絕對回收率最高的實驗條件，以全掃描模式考察目標物與雜質(zhì)的共流出情況，發(fā)現(xiàn)目標物峰與雜質(zhì)峰基本實現(xiàn)了基線分離，即該條件下可有效降低基質(zhì)效應(yīng)。最終，流動相A采用甲醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸銨)，流動相B采用異丙醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸銨)按“1.3”的梯度洗脫條件進行分離。在該條件下，3-MCPD-DP標準溶液和實際樣品的MRM色譜圖見圖1，可見在保留時間處較好地排除了雜質(zhì)峰的干擾，峰較窄，可獲得最佳的分析效果。

圖1 標準溶液(A)和實際樣品(B)中3-MCPD-DP的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 3-MCPD-DP in standard solution(A) and real oil sample(B)

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 定容液的選擇采用甲醇、乙腈、異丙醇、乙腈-異丙醇(1∶1)4種溶劑作為定容液對3-MCPD-DP的分離效果進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙醇作為定容液時，3-MCPD-DP的色譜峰分叉且峰寬；乙腈-異丙醇(1∶1)作為定容液時，峰形有改善，但信噪比較低，峰形分叉且不對稱，推測與這兩種定容液同初始流動相甲醇不能迅速互溶成均勻溶液有關(guān)，通過目測亦發(fā)現(xiàn)異丙醇與甲醇的互溶速度比乙腈與甲醇的溶解速度慢，因此這兩種溶劑均不適合作為定容液；而采用甲醇、乙腈做為定容液時色譜峰對稱、峰寬窄、信噪比高(見圖2)。實驗最終選擇與初始流動相具有更好互溶性的甲醇為定容液。

圖2 3-MCPD-DP在不同定容液下的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 3-MCPD-DP in different solutionsa.isopropyl alcohol;b.acetonitrile-isopropyl alcohol(1∶1);c.methanol;d.acetonitrile

2.2.2 固相萃取柱吸附劑用量的選擇C18可吸附油脂樣品中的三?；视图跋炠|(zhì)[6]，PSA因具有較強的離子交換能力和絡(luò)合作用，可吸附油脂中的脂肪酸、有機酸、極性色素、酚類及金屬離子等[19]，將兩種吸附劑同時使用可明顯改善油脂樣品的凈化效果。分別取等重的PSA、C18吸附劑混合均勻后裝入SPE空管中壓實,即得分析用固相萃取柱。進一步對吸附劑用量進行優(yōu)化，分別稱取PSA、C18吸附劑各100、200、300、400、500、600、700、800 mg等比例混合裝柱后，將1.0 mL 3-MCPD-DP加標濃度為100 ng/mL的橄欖油樣液上柱凈化，乙腈-異丙醇(1∶1)洗脫，收集5 mL，經(jīng)氮吹至干，甲醇定容，過濾膜后上機測試比較。同時取100 ng/mL溶劑標準溶液按同樣方法處理，以比較基質(zhì)存在與否時吸附劑對3-MCPD-DP的影響。結(jié)果顯示，溶劑標液與基質(zhì)加標樣液在凈化柱中具有不同的洗脫行為，隨著吸附劑含量的增加，溶劑標液的峰面積依次降低，表明吸附劑對溶劑標液中的3-MCPD-DP有吸附作用，且吸附劑含量越高，吸附的目標物也越多。而基質(zhì)加標樣液中，3-MCPD-DP的峰面積基本處于同一響應(yīng)水平，說明存在基質(zhì)時，吸附劑用量的增加不會影響3-MCPD-DP的響應(yīng)，這可能是吸附劑優(yōu)先與樣品基質(zhì)相互作用所致；且在上標凈化樣品量相同的條件下，吸附劑用量的增加對基質(zhì)的凈化效果無明顯差異?？紤]到不同樣品基質(zhì)的差異，為保證吸附劑活性位點的充足性，最終選擇PSA、C18吸附劑均500 mg作為有效吸附劑用量。

圖3 不同洗脫溶劑的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of different elution solvents

2.2.3 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化采用PSA+C18吸附劑用量均為500 mg，乙腈-異丙醇(1∶1)為洗脫液時，通過研究不同稱樣量、不同洗脫體積下3-MCPD-DP的峰面積響應(yīng)以確定最佳樣品凈化量。分別稱取0.1、0.1、0.2 g橄欖油樣品，基質(zhì)加標使含100 ng/mL 3-MCPD-DP，分別移取1、2、1 mL樣液上柱凈化，并從上柱起每1 mL乙腈-異丙醇(1∶1)溶液收集，建立洗脫曲線。結(jié)果顯示，初始1 mL時目標物的峰面積響應(yīng)均可忽略不計，前7 mL洗脫的目標物均可達98%以上，最終以稱樣量0.1 g,上柱凈化體積2 mL為最優(yōu)樣品凈化量。

同時通過研究PSA+C18吸附劑用量均為500 mg時，不同洗脫溶液下的洗脫曲線以確定最佳洗脫液。在前述研究中，使用乙腈-異丙醇(1∶1)為洗脫液時，需7 mL才能洗脫98%以上的目標物，因此考慮增加洗脫液強度，使目標物更早洗脫。在此固相萃取柱中，異丙醇比乙腈具有更強的洗脫能力，因此比較了乙腈(ACN)與異丙醇(IPA)的體積比分別為1∶1、2∶8、0∶10時的洗脫曲線。結(jié)果顯示乙腈與異丙醇的體積比為2∶8時，目標物能更早地洗脫，且較體積比為0∶10時具有更低的基質(zhì)效應(yīng)。從峰面積來分析，體積比為2∶8時目標物的洗脫更集中，在第3～6 mL時洗脫量可達98%以上。最終，確定洗脫液為乙腈-異丙醇(2∶8)，棄去初始2 mL流出液，收集4 mL洗脫液為最佳洗脫條件(見圖3)。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

取陰性油脂樣品，以凈化后的空白樣品基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配標準溶液，與甲醇溶液配制的同濃度標準溶液的峰面積進行比較，當比值為80%～120%時，表明基質(zhì)效應(yīng)較小[19]，以此來衡量方法的基質(zhì)效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，當稱樣量為0.1 g且經(jīng)凈化時，基質(zhì)匹配標準溶液的峰面積與溶劑標準溶液的峰面積比約為67%；當稱樣量為0.2 g且經(jīng)凈化時，峰面積比約為43%；當稱樣量為0.2 g且未經(jīng)凈化時，峰面積比僅為18%。表明樣品經(jīng)前處理后得到一定程度的凈化，但不能完全消除基質(zhì)效應(yīng)。因此，實驗選擇稱樣量0.1 g，并采用同位素內(nèi)標法以降低基質(zhì)效應(yīng)，此時可直接采用溶劑標準曲線進行內(nèi)標法定量分析。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

移取適量3-MCPD-DP標準溶液和D5-3-MCPD-DP標準溶液，用甲醇逐級稀釋，得到濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列標準工作溶液，上機測定。以3-MCPD-DP與D5-3-MCPD-DP標準溶液的峰面積比為縱坐標，質(zhì)量濃度比為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性方程。結(jié)果表明，3-MCPD-DP在0.5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.999)；以信噪比S/N≥3和信噪比S/N≥10計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，測得LOD可達0.025 mg/kg，LOQ可達0.050 mg/kg。

2.5 回收率與相對標準偏差

稱取橄欖油樣品20份，其中2份做本底，其他18份分成3組(每組6份)，分別按低、中、高3個水平添加0.1、0.2、0.5 mg/kg的3-MCPD-DP，加入100 μL 1 μg/mL的D5-3-MCPD-DP工作液，經(jīng)凈化后進行測定，計算方法回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示，在上述3個加標水平下該方法的平均回收率分別為90.8%、102%、100%(n=6)，相應(yīng)的RSD分別為1.1%、3.0%、1.5%(n=6)，均滿足GB/T 27404-2008附錄F[20]的要求。

2.6 實際樣品的分析

為了考察了本方法對其他品種食用油脂的適用性，對市售玉米胚芽油、大豆油、花生油等3種不同油脂中的3-MCPD-DP含量進行平行檢測，并分別加標0.5、1.0 mg/kg以考察加標回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米胚芽油中3-MCPD-DP實際含量為0.063 mg/kg，2種加標水平下的回收率分別為106%、108%，其RSD為1.8%；大豆油及花生油均未檢出，其中2種加標水平下大豆油的回收率均為109%，其RSD為0.1%；花生油的回收率分別為 103%和97.4%，其RSD為3.7%。本方法可用于玉米胚芽油、大豆油、花生油3種不同油脂中3-MCPD-DP含量的測定。

3 結(jié) 論

本研究建立了實驗室自填裝PSA+C18吸附劑的固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測油脂中3-MCPD-DP的方法。該方法操作簡便、結(jié)果準確，通過固相萃取柱凈化，可有效去除油脂的基質(zhì)干擾，方法的靈敏度、適用性及確證可靠性等方面均符合質(zhì)量控制要求，在實用性上可滿足油脂中3-MCPD-DP的準確定量檢測。