劉鑫路，周 秀，吳運(yùn)萍

1.連云港市第二人民醫(yī)院輸血科，江蘇 連云港 222002；2.天津市武警醫(yī)療中心輸血科，天津 300000

抗-G抗體通常只與帶有D或/和C抗原紅細(xì)胞反應(yīng)，也被稱為抗-DC，抗-G常伴隨抗-D出現(xiàn)?；純撼錾延?7天，血清中抗-G抗體已減弱，最開始只檢出抗-D抗體，選用ABO同型RhD陰性血進(jìn)行交叉配血時，主側(cè)發(fā)生凝集反應(yīng)考慮還存在其他同種抗體，分別用PEG增強(qiáng)方法、酶處理試劑紅細(xì)胞方法后檢出抗-D抗體和抗-C抗體，經(jīng)用兩次吸收方法鑒定為抗-D合并抗-G，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者為新生兒，女，27天，末次輸血時間2019年11月15日，Hb：125g/L，為糾正貧血，申請輸血。

1.2 儀器與試劑

抗-A，抗-B，抗-D（IgM），抗-D（IgG），抗-C，抗-c，抗-E，抗-e（批 號： 20171227， 20181810，20183001，20180626，20183101，20183201，20183301）；抗球蛋白（IgG、C3d）試劑（批號：20185001）；ABO細(xì)胞及篩選細(xì)胞（批號：20195326，20197031）；聚凝胺試劑（批號：20197502）；均由上海市血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供。酸釋放劑（批號：20180423）由上海申型醫(yī)學(xué)科技有限公司提供?？?D（IgM+IgG）（批號：8000249683）；進(jìn)口譜細(xì)胞（批號：8000260167）來自荷蘭sanquin公司。抗人球蛋白卡（批號：50531.38.18）購自DiaMed公司。

1.3 方法

1.3.1 血型鑒定：采用鹽水法按照文獻(xiàn)［1］操作。

1.3.2 不規(guī)則抗體篩查及鑒定：抗體篩查采用鹽水法、聚凝胺法、抗人球蛋白法（凝膠卡）按生產(chǎn)廠家使用說明書進(jìn)行操作和判讀，設(shè)置自身對照，根據(jù)與進(jìn)口譜紅細(xì)胞的反應(yīng)格局判定抗體特異性。

1.3.3 抗體效價檢測：根據(jù)血清稀釋度標(biāo)記10支試管(如1，2，4等)。1代表1體積未稀釋血清，2代表1體積血清被稀釋至2體積。除第1管，其余每支試管中加50 ul生理鹽水。前兩管(1和2)中，各加50 ul待檢血清，用移液槍頭吹吸、混勻2中的液體數(shù)次，轉(zhuǎn)移50 ul至下一支試管，重復(fù)相同的步驟，直至完成所有倍比稀釋。每管加50 ul，2%～3%紅細(xì)胞懸液，充分混勻，37℃孵育30 min，以1 000離心15 s觀察記錄結(jié)果。

1.3.4 PEG增強(qiáng)方法做抗體鑒定：依據(jù)進(jìn)口譜細(xì)胞的數(shù)量取16只潔凈試管，分別標(biāo)記序號，另取一支潔凈試管記為自身對照。加2滴待檢血清，4滴20%PEG，加入1滴2%～5%的紅細(xì)胞懸液。37℃孵育15 min。用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，棄上清液。加入2滴抗人球蛋白1 g G試劑(具體請參照說明書)混勻，1 000 g離心15 s后觀察結(jié)果。

1.3.5 酶處理試劑紅細(xì)胞方法做抗體鑒定：將木瓜酶稀釋液轉(zhuǎn)移至粉劑瓶中，充分溶解后，按日常工作量用潔凈試管分裝成數(shù)個小包裝，置-20℃凍存。每次可用1個小包裝，當(dāng)天剩余液體應(yīng)棄去(酶的實(shí)際用量和孵育時間遵照試劑說明書)。取1體積進(jìn)口譜細(xì)胞和自身細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3遍，最后遍棄去上清液，留紅細(xì)胞沉淀;輕輕搖散紅細(xì)胞沉淀，加入1體積步驟一配制的酶液。經(jīng)37℃孵育15 min。用大量生理鹽水洗滌酶處理過的紅細(xì)胞3次，然后制成2%～3%的紅細(xì)胞生理鹽水懸液。取17支潔凈試管分別做好標(biāo)記。每支試管中加入2滴患者血清(或血漿)。分別于對應(yīng)試管加入1滴對應(yīng)的酶處理過的2%～5%的進(jìn)口譜細(xì)胞和自身紅細(xì)胞，混勻。經(jīng)37℃，孵育1 min。經(jīng)1 000 g離心15 s，觀察有無凝集和溶血，記錄結(jié)果。如有凝集反應(yīng)則為陽性結(jié)果，不必進(jìn)行以下程序。如未觀察到凝集反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行以下程序。用生理鹽水洗滌4遍，最后一遍徹底棄去上清液。加入抗人球蛋白試劑(劑量參照試劑說明書)，混勻。經(jīng)1 000 g離心15 s，觀察反應(yīng)結(jié)果。如為陰性反應(yīng)，則加IgG致敏的紅細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.6 吸收放散試驗(yàn)及抗體效價測定：吸收實(shí)驗(yàn)操作按照文獻(xiàn)［2］操作。酸放散試驗(yàn)按照生產(chǎn)廠家使用說明書進(jìn)行操作，放散液與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞作用離心后觀察結(jié)果。

1.3.7 直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)：按照文獻(xiàn)［3］直接Coombs’實(shí)驗(yàn)試管法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。

2 結(jié)果

2.1 ABO和Rh血型

患兒血型為O型，Rh陰性，經(jīng)Rh血型確認(rèn)試驗(yàn)后仍為陰性。紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)陰性，血清抗體篩查試驗(yàn)陽性，Rh血型其他因子為抗-c和抗-e陽性，因此Rh表型為dce/dce。

2.2 譜細(xì)胞反應(yīng)格局

為明確血清中的不規(guī)則抗體，應(yīng)用16只一組的進(jìn)口譜細(xì)胞對抗體進(jìn)行鑒定，初步分析血清中含有抗-C+D抗體，效價為32。

2.3 直抗結(jié)果

患兒直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)陰性。

2.4 交叉配血結(jié)果

選擇三例O型dCe/dCe獻(xiàn)血者和三例dce/dce獻(xiàn)血者紅細(xì)胞與患者的血清進(jìn)行交叉配血主側(cè)反應(yīng)，結(jié)果顯示該患者血清能凝集dCe/dCe獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞，而與dce/dce獻(xiàn)血者紅細(xì)胞沒有凝集，說明該患者含有抗-C抗體。我們選用O型Rh分型dce/dce獻(xiàn)血者紅細(xì)胞0.5單位治療，效果良好。

2.5 抗-G抗體鑒定

患兒父親Rh分型為DcE/dce，患兒母親血清（O型Rh分型dce/dce）與患兒血型分型一致，患兒母親正常分娩不能產(chǎn)生抗-C抗體。故患兒血清可能存在抗-G抗體而不是抗-C抗體。我們用血清分別Dce/Dce和dCe/dCe壓積紅細(xì)胞做吸收試驗(yàn)，結(jié)果用和Dce/Dce壓積紅細(xì)胞吸收后的血清不能與dCe/dCe及Dce/Dce紅細(xì)胞發(fā)生凝集。再將用和Dce/Dce壓積紅細(xì)胞進(jìn)行酸放散試驗(yàn)，放散液仍可以和dCe/dCe及Dce/Dce紅細(xì)胞發(fā)生凝集。說明血清中不含有單獨(dú)的抗-C抗體。結(jié)果用和dCe/dCe和dCe/dCe紅細(xì)胞吸收后的血清不能與dCe/dCe紅細(xì)胞發(fā)生凝集，但仍能與Dce/Dce紅細(xì)胞發(fā)生凝集。再將用和dCe/dCe和dCe/dCe壓積紅細(xì)胞進(jìn)行酸放散試驗(yàn)，放散液仍可以和dCe/dCe及Dce/Dce紅細(xì)胞發(fā)生凝集。說明血清中含有單獨(dú)的抗-D抗體。因此可以證實(shí)患兒血清中為-D+G抗體［4］。

3 結(jié)論

一般情況下，抗-G只與帶有D或/和C抗原的紅細(xì)胞反應(yīng)，RHD和RHCE的C等位基因所編碼的Ser103是G活性的關(guān)鍵，一般帶有D和/或C紅細(xì)胞均為G陽性［5］?？?G可以應(yīng)用rG/dce或r/G/dce細(xì)胞經(jīng)吸收/放散實(shí)驗(yàn)分離出來，但這類紅細(xì)胞非常少見和難以得到［6］。本例患兒我們采用Dce/Dce和dCe/dCe壓積紅細(xì)胞進(jìn)行兩次吸收放散，確定患兒血清中的抗體為-D+G抗體。本例患兒母親之前既有輸血史又有妊娠史，而妊娠和輸血的同種免疫是Rh同種抗體產(chǎn)生的主要原因。本例患兒母親產(chǎn)生-D+G抗體與輸血史及妊娠史有關(guān)。在妊娠期間由于反復(fù)的“經(jīng)胎盤出血”，胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入母體，刺激母體內(nèi)產(chǎn)生與胎兒紅細(xì)胞不配合的IgG性質(zhì)的血型抗體，這些抗體可通過胎盤屏障回到胎兒體內(nèi)，最終導(dǎo)致胎兒紅細(xì)胞溶血被破壞。若是受血者或者是孕婦血漿中存在Rh抗體，當(dāng)與含相應(yīng)抗原的血液相遇后，便會導(dǎo)致嚴(yán)重的輸血反應(yīng)或者新生兒溶血病的發(fā)生。由于本例患兒ABO血型及Rh分型與母親相同，母親體內(nèi)Rh血型抗體雖然通過胎盤屏障回到胎兒體內(nèi)但并不會導(dǎo)致新生兒溶血的發(fā)生。因此患兒貧血可能由于其他疾病原因造成的。由于患兒血清中含有Rh血型抗體，在輸血時要選擇不含對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞進(jìn)行輸注。如果只輸注RhD陰性血，仍有可能因?yàn)榭乖贵w相遇后會造成溶血反應(yīng)，影響輸血效果。從免疫血液學(xué)角度看，Rh血型系統(tǒng)最主要的5個抗原中，免疫原性強(qiáng)弱順序依次為D，E，C，c，e，這5種抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合均能引起嚴(yán)重的血液免疫學(xué)反應(yīng)，如溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病(HDN)和自身免疫性溶血性貧血等。如今人們對于RhD抗原的認(rèn)識已較充分，其余抗原則重視程度不高。在RhD抗原陰性患者，多次妊娠育齡期婦女，需要多次輸血治療的患者要常規(guī)檢測RhC、Rhc、RhE、Rhe抗原，進(jìn)行Rh血型系統(tǒng)分型，進(jìn)行ABO血型系統(tǒng)與Rh血型系統(tǒng)同型輸注，減少因Rh血型系統(tǒng)不同型輸注引起的Rh血型系統(tǒng)抗體的產(chǎn)生率，減少由于回憶性免疫應(yīng)答引起的遲發(fā)性溶血反應(yīng);避免臨床輸血中由于Rh血型系統(tǒng)抗體產(chǎn)生引起的交叉配血不合貽誤搶救輸血時機(jī)，及時挽救患者生命。因此在臨床單獨(dú)常規(guī)檢測Rh血型系統(tǒng)RhD抗原是不能滿足臨床合理安全輸血要求的。而對Rh主要的五個抗原常規(guī)進(jìn)行檢測，并給與Rh分型進(jìn)行同型血液輸注，可有效避免因輸血而產(chǎn)生Rh同種抗體，減少輸血風(fēng)險，這也是未來精準(zhǔn)輸血的要求。