楊琛擘，曹明卓，劉明閣，申培紅

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 臨床病理中心，河南 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)系，河南 鄭州 450046)

2020年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布腫瘤統(tǒng)計(jì)報(bào)告，女性中最常見(jiàn)的癌癥是乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌，占新發(fā)病例數(shù)過(guò)半，其中乳腺癌獨(dú)占新發(fā)病例數(shù)的30%[1]。Luminal B型乳腺癌是乳腺癌分子分型中最常見(jiàn)的亞型，占47.7%～52.8%[2-3]。Luminal B型乳腺癌發(fā)病率高，激素受體低表達(dá)，增殖指數(shù)Ki67高表達(dá)，與Luminal A型乳腺癌比較，內(nèi)分泌治療效果差、往往預(yù)后不良[4]。面對(duì)Luminal B乳腺癌高發(fā)病率和預(yù)后不良的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，科學(xué)家和臨床醫(yī)生研究了多種抗擊癌癥的方法，如外科手術(shù)治療、化療、放療，但存在副作用大、產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題[5-7]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的、更安全、更有效和靶向性乳腺癌治療方法，基因治療目前在腫瘤、血友病以及失明等疾病的治療中均取得了重大進(jìn)展[8]。乳腺癌特異性基因1(breast cancer specific gene 1，BCSG1)已被證明在乳腺癌中具有特異性，是乳腺癌診斷和治療的靶點(diǎn)[9]。利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療，可能達(dá)到安全高效治療乳腺的目標(biāo)。本文對(duì)BCSG1、BCSG1-siRNA和陽(yáng)離子聚合物siRNA輸送體系進(jìn)行回顧性綜述，探討開(kāi)發(fā)乳腺癌治療的新技術(shù)。

1 Luminal B型乳腺癌概述

1.1 Luminal B型乳腺癌臨床病理特征Luminal B型乳腺癌判斷標(biāo)準(zhǔn)為ER陽(yáng)性、PR陰性或低表達(dá)、Her2陰性、Ki67高表達(dá)。Cintra等[10]回顧性分析397例乳腺癌患者，經(jīng)過(guò)免疫組化檢查，40歲以下患者中Luminal B型乳腺癌比例最高，且組織學(xué)分級(jí)較Luminal A型乳腺癌高，以Ⅱ～Ⅲ級(jí)為主。研究示，與Luminal A型乳腺癌相比，Luminal B型乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例更高[11]。徐國(guó)萍等[12]對(duì)145例Luminal A型和Luminal B型乳腺癌進(jìn)行研究，Luminal B型有39.76%患者存在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，高于Luminal A型(16.13%)，Luminal B型乳腺癌總體表現(xiàn)病情更嚴(yán)重。

1.2 Luminal B型乳腺癌預(yù)后較差Desmedt等[13]對(duì)831例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Luminal B型乳腺癌5 a內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率是Luminal A型乳腺癌的2.86倍，提示Luminal B型乳腺癌更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究示，Luminal B型乳腺癌5年總生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存率均低于Luminal A型乳腺癌，證實(shí)Luminal B型乳腺癌預(yù)后差、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高[11,14]。

2 BCSG1基因概述

2.1BCSG1基因的發(fā)現(xiàn)1997年，Ji等[15]通過(guò)直接差異cDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)一組在人乳腺癌中高表達(dá)但在正常和良性乳腺腫瘤組織中不表達(dá)的基因，稱為BCSG1。BCSG1被認(rèn)為是人類突觸核蛋白基因家族的新成員，與神經(jīng)元突觸核蛋白(synucleins，SNCs)家族中SNGG僅有4個(gè)不同核苷酸的區(qū)別，且3’端非編碼區(qū)無(wú)差異，則普遍認(rèn)同BCSG1與SNGG具有同源性[16]。

2.2 BCSG1的功能有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制通過(guò)一系列蛋白檢測(cè)紡錘體的正確裝配，以保證染色體完整復(fù)制，若蛋白受其他因素干擾或其表達(dá)基因突變，異常細(xì)胞將可能逃逸有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制，可以無(wú)障礙地通過(guò)有絲分裂期而不斷增殖或產(chǎn)生異形的非整倍體細(xì)胞。人類細(xì)胞中有絲分裂開(kāi)關(guān)激酶(BubR1)是重要的有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)功能蛋白之一，在人類乳腺癌組織中，BubR1的異常作用導(dǎo)致有絲分裂功能喪失，并使乳腺癌細(xì)胞不受限制地增殖，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。BubR1是BCSG1的反應(yīng)蛋白，提示BCSG1可以抑制細(xì)胞有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制，促進(jìn)癌細(xì)胞的不受控制的增殖[17]。Liu等[18]認(rèn)為BCSG1是一種伴侶蛋白，可與多種蛋白結(jié)合形成依賴于熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的伴侶復(fù)合物，從而促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌的激素反應(yīng)性生長(zhǎng)，通過(guò)免疫共沉淀證實(shí)游離ER-ɑ可與BCSG1、HSP90、HSP70結(jié)合形成復(fù)合物，并且這種結(jié)合顯著增加了其配體親和力，但這一效應(yīng)可被HSP90阻滯劑逆轉(zhuǎn)，這表明BCSG1對(duì)ER-ɑ配體親和力的影響有賴HSP的參與。BCSG1與熱休克蛋白共同形成復(fù)合物，ER-ɑ在復(fù)合物作用下，激活Wnt通路，β-catenin入核繼而與核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)，參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

2.3 BCSG1在乳腺癌中特異性高表達(dá)BCSG1在乳腺癌中特異高表達(dá)及其與乳腺癌進(jìn)程相關(guān)性已被世界上多個(gè)獨(dú)立科研單位所證實(shí)。Bruening等[19]通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析未能在正常乳腺組織中檢測(cè)到BCSG1，而82%(14/17)的Ⅲ/Ⅳ期乳腺導(dǎo)管癌表達(dá)BCSG1，BCSG1對(duì)于乳腺癌分期、預(yù)后和進(jìn)展具有重要意義。Guo等[20]分析了438例臨床乳腺標(biāo)本中BCSG1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BCSG1的表達(dá)與分期、淋巴結(jié)受累、轉(zhuǎn)移和腫瘤大小密切相關(guān)。中位隨訪64個(gè)月后，BCSG1陽(yáng)性腫瘤患者的無(wú)病生存期和總生存期明顯短于BCSG1不表達(dá)的患者。BCSG1是乳腺癌進(jìn)展的不良預(yù)后標(biāo)志，也是乳腺癌治療的潛在靶標(biāo)。Shen等[21]研究示，BCSG1在進(jìn)展期乳腺癌中特異性高表達(dá)，在導(dǎo)管原位癌有部分表達(dá)，隨著癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移程度的增加，BCSG1表達(dá)率也增加，在部分原位癌組織中BCSG1明顯表達(dá)的癌組織與間質(zhì)分界明顯，形成不規(guī)則交界線，BCSG1靈敏度(真陽(yáng)性)=76.61%；特異率(陰性)=97.50%，BCSG1特異性表達(dá)與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)，與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。BCSG1特異高表達(dá)與乳腺癌惡性分級(jí)和浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)，BCSG1與MMP2、VEGF、CD105、Bcl2、Ki67基因呈正相關(guān)，BCSG1促進(jìn)腫瘤組織血管生成，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是發(fā)展新的治療方法的新靶點(diǎn)[21-23]。

3 BCSG1-siRNA與乳腺癌

3.1 siRNA在RNAi分子機(jī)制中的重要作用在RNAi的初始階段，由于轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、外源基因的引入等，dsRNA出現(xiàn)在細(xì)胞中，特異性核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA裂解為21～23 nt長(zhǎng)的siRNA。新產(chǎn)生的siRNA與幾種關(guān)鍵蛋白形成沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC中的Argonaute2蛋白將siRNA解鏈成單鏈，有義鏈被降解，反義鏈與目標(biāo)mRNA上的相應(yīng)堿基序列配對(duì)，導(dǎo)致靶mRNA在相應(yīng)的基因序列上被切割，3’末端序列在細(xì)胞質(zhì)中被酶降解。RISC從被破壞的靶標(biāo)mRNA上分離并繼續(xù)切割其他靶標(biāo)mRNA，最終使靶基因mRNA無(wú)法表達(dá)以抑制靶標(biāo)基因[24]。

3.2 siRNA在基因治療中的優(yōu)勢(shì)siRNA可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并與RISC的發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而啟動(dòng)RISC沉默基因的過(guò)程。人工合成的siRNA可以靶向目的癌基因，被引入癌細(xì)胞中特異性抑制靶基因的表達(dá)。與其他治療技術(shù)相比，siRNA具有特異性高、效率高、穩(wěn)定性和安全性高、副作用低的優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到了基因治療的目標(biāo)[25]。

3.3 BCSG1-siRNA治療乳腺癌Shen等[26]構(gòu)建了BCSG1-siRNA，并將其轉(zhuǎn)染到人乳腺癌MCF7細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)BCSG1-siRNA特異性抑制MCF7細(xì)胞中BCSG1蛋白和mRNA的表達(dá)，用MCF7細(xì)胞建立種植瘤模型，然后將BCSG1-siRNA注射到種植瘤中，發(fā)現(xiàn)BCSG1-siRNA特異性抑制種植瘤中BCSG1蛋白和mRNA的表達(dá)。將BCSG1-siRNA轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)不僅抑制BCSG1的表達(dá)，而且干擾腫瘤的血管侵襲和轉(zhuǎn)移，影響S100A4、ETS1、VEGF和CD105的表達(dá)[27]。He等[28]通過(guò)慢病毒載體向乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中遞送BCSG1-siRNA，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中BCSG1-mRNA水平明顯降低，細(xì)胞遷移增殖能力明顯降低，細(xì)胞周期停止。研究表明，應(yīng)用BCSG1-siRNA靶向沉默BCSG1治療乳腺癌具有理論和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

4 電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物輸送體系

4.1 電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物具備的優(yōu)勢(shì)(1)高活性陽(yáng)離子聚合物帶有豐富的陽(yáng)離子，易于與帶負(fù)電荷的siRNA形成復(fù)合物，通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物[29]。(2)將siRNA封裝到惰性納米顆粒中以形成一個(gè)密封的環(huán)境，可以有效地防止外界因素的干擾，防止siRNA被血漿核酸酶降解。此外，通過(guò)修飾載體上的官能團(tuán)，減少非特異性分布并增加血液的半衰期和靶組織中的siRNA濃度[29]。(3)避免肝臟代謝，對(duì)納米顆粒進(jìn)行一些調(diào)整，如藥物蛋白質(zhì)修飾。避免腎臟清除需要調(diào)節(jié)納米顆粒的粒徑和電荷，大于8 nm的納米顆粒和更多的陰離子不易被腎臟排泄[30]。(4)由于腫瘤組織中的血管繁多、血管結(jié)構(gòu)異常和淋巴引流失調(diào)，腫瘤組織具有高滲透性并截留大分子的現(xiàn)象，稱EPR效應(yīng)[31]。但在許多情況下，EPR效應(yīng)對(duì)于腫瘤組織中siRNA的富集并不令人滿意。利用在靶細(xì)胞表面上過(guò)表達(dá)的抗原或受體，將具有特定識(shí)別能力的配體與載體連接，設(shè)計(jì)出靶向陽(yáng)離子聚合物載體[32]。(5)調(diào)節(jié)載體表面的電荷性質(zhì)是保持其在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，能夠通過(guò)腫瘤內(nèi)吞作用快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的重要方法[33]。

4.2 電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用Qiu等[34]設(shè)計(jì)了{(lán)N- [2-(丙烯酰氧基)乙基]-N-[對(duì)乙酰氧基苯基]-N，N-二乙基氯化銨}酶響應(yīng)性電荷反轉(zhuǎn)載體，具有低細(xì)胞毒性和可快速釋放藥物的特性。Xu等[35]研究了包含PEG和PLGA的pH響應(yīng)型siRNA遞送聚合物(PEG-Dlinkm PLGA)，由于聚乙二醇化，包裹siRNA的PEG-Dlinkm-PLGA有效地延長(zhǎng)血液循環(huán)并優(yōu)先富集腫瘤部位。PEG-Dlinkm-PLGA在腫瘤組織的酸性微環(huán)境中作出反應(yīng)，使PEG表面層脫離，促進(jìn)細(xì)胞攝取，siRNA在腫瘤細(xì)胞中快速釋放。Cui等[36]報(bào)道了由殼聚糖/羧甲基殼聚糖形成的雙殼核結(jié)構(gòu)介孔二氧化硅電荷反轉(zhuǎn)陽(yáng)離子聚合物，具有在不同pH環(huán)境下反轉(zhuǎn)電荷的能力，能夠在腫瘤組織中快速而特異性地釋放藥物。

5 總結(jié)與展望

面對(duì)Luminal B型乳腺癌高發(fā)病率和高死亡率，迫切需要開(kāi)發(fā)新的Luminal B乳腺癌治療策略，提高患者的生存率。BCGS1的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，抑制BCSG1表達(dá)可有效控制乳腺癌的進(jìn)程并提高治療效果，BCSG1還增強(qiáng)了癌細(xì)胞在不利環(huán)境中的生存能力，使BCSG1成為治療乳腺癌的潛在靶標(biāo)。通過(guò)將BCSG1-siRNA遞送至乳腺癌組織以特異性沉默BCSG1的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)基因治療的目標(biāo)。但由于siRNA藥物的穩(wěn)定性差，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染率低和靶向性差，siRNA藥物的臨床應(yīng)用受到限制。應(yīng)用電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物作為載體，可以有效保護(hù)siRNA避免過(guò)早降解，減少體內(nèi)生物屏障對(duì)siRNA的捕獲和消除。因此，利用電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物搭載BCSG1-siRNA治療乳腺癌，為乳腺癌治療的發(fā)展提供了新的方向，有望提高乳腺癌患者生存率和生存質(zhì)量。