黃潔，吳星偉

年齡相關(guān)性黃斑變性 （age-related macular degeneration，AMD）是發(fā)達國家老年人失明最主要的原因[1]，目前全球大約3000 萬AMD 患者，每年約50 萬人因AMD 而致盲[2]。AMD 分為干性AMD 和濕性AMD，2002 年對上海靜安區(qū)曹家渡街道進行AMD 的調(diào)查顯示，50 歲以上人群中AMD 的發(fā)病率高達15.5%，其中干性AMD 占88.1%[3]。年齡是AMD 最大的危險因素，抽煙、飲酒、陽光暴露及高脂肪攝入都會增加AMD的風險[4-5]?？寡軆?nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在濕性AMD 的治療中取得顯著臨床療效[6]，但是對于干性AMD 目前尚無有效的治療方法。目前有多種藥物仍處于臨床試驗當中，包括抗氧化劑、神經(jīng)保護劑、抑制炎癥反應(yīng)類藥物、增加脈絡(luò)膜血流藥物等，但未取得突破性進展[7-8]。合適的動物模型對干性AMD 的研究至關(guān)重要，有助于藥物的研發(fā)。目前，有多種針對干性AMD 的不同發(fā)病機制進行干預(yù)的動物模型，現(xiàn)對各種動物模型綜述如下，以期為干性AMD 的研究提供幫助。

1 與AMD 致病基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因鼠動物模型

研究證明，AMD 的病理過程涉及氧化應(yīng)激、免疫炎癥、脂及碳水化合物的代謝。目前已經(jīng)篩選出一系列相關(guān)的候選基因建立相應(yīng)的AMD 小鼠模型。

1.1 單核細胞趨化因子2 及受體敲除模型

炎癥反應(yīng)是AMD 發(fā)病的主要機制之一，巨噬細胞是清除補體及免疫復(fù)合物的主要細胞，其功能受損導(dǎo)致免疫復(fù)合物的堆積，引起功能障礙。超過9 個月的單核細胞趨化因子2（chemokine 2，Ccl2）基因敲除（Ccl2-/-）小鼠眼底可見視網(wǎng)膜下沉積物，類似drusen 樣改變，其數(shù)量隨年齡的增長而增多，視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，PRE） 細胞出現(xiàn)水腫、空泡化及電子致密物的沉積，Bruch 膜增厚；而10～12 個月齡時出現(xiàn)膠原層及彈力層破裂，隨著小鼠的衰老視網(wǎng)膜出現(xiàn)地圖樣萎縮，RPE 持續(xù)變性及CNV 形成。20 個月齡Ccl2-/-小鼠的RPE 中開始過度表達VEGF，脈絡(luò)膜毛細血管擴張，Bruch 膜的外層出現(xiàn)斷裂[9]。該模型說明了Ccl2 在AMD 的發(fā)病過程中具有重要作用。伴隨著Ccl2-/-小鼠模型的衰老，RPE和脈絡(luò)膜中的補體和IgG 沉積。由補體C5 和IgG 誘導(dǎo)的RPE 或脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的Ccl2 可介導(dǎo)脈絡(luò)膜巨噬細胞浸潤到老化的野生型小鼠脈絡(luò)膜中，降解Ccl2-/-或單核細胞趨化因子2 受體 （chemokine receptor 2，Ccr2） 基因敲除（Ccr2-/-）小鼠眼部的補體C5 和IgG。Ccl2-/-及Ccr2-/-小鼠再現(xiàn)了早期干性AMD 及晚期濕性AMD 類似的病理特征，提示巨噬細胞募集功能受損是AMD 的重要發(fā)病機制。

1.2 載脂蛋白E 基因敲除模型

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因與脂代謝有關(guān)，高脂與高膽固醇飲食是AMD 發(fā)病的重要危險因素。有研究[10]顯示，對2 個月齡的ApoE 基因敲除（ApoE-/-）鼠進行高脂飲食喂養(yǎng)4 個月后小鼠視網(wǎng)膜光感受器及RPE 層出現(xiàn)萎縮及排列紊亂，Bruch 膜厚薄不均，出現(xiàn)drusen 沉積，符合干性AMD 的臨床特點。作為脂代謝模型，該模型需要高脂喂養(yǎng)，成模時間長，動物容易罹患動脈粥樣硬化導(dǎo)致心臟病。

1.3 超氧化物歧化酶1 及超氧化物歧化酶2 基因敲除模型

氧化應(yīng)激是AMD 形成的機制之一，氧化應(yīng)激導(dǎo)致視網(wǎng)膜PRE 及感光細胞的損傷。超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase-1，Sod1）是視網(wǎng)膜抗氧化損傷的主要成員。Sod1 基因敲除（Sod1-/-）小鼠7 個月齡可觀察到眼底drusen 形成，12個月齡可觀察到RPE 細胞的空泡化及變性，17%出現(xiàn)感光細胞減少[11]。Sod2-/-小鼠模型，視網(wǎng)膜下注射腺相關(guān)病毒-核酶介導(dǎo)的Sod2 mRNA 敲除Sod2 基因的動物模型2～4 個月可以觀察到RPE 細胞出現(xiàn)空泡，光感受器細胞層結(jié)構(gòu)紊亂，外核層變薄及Bruch 膜變厚[12]。Sod1-/-及Sod2-/-模型模擬了干性AMD 的病理過程，證實了氧化應(yīng)激在AMD 發(fā)病過程中的作用。

1.4 核因子E2 相關(guān)因子基因敲除模型

核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-derived factor2-related factor，Nrf2）與抗氧化反應(yīng)原件通路，是機體抵御各種氧化應(yīng)激的重要保護通路。Zhao 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 基因敲除（Nrf2-/-）小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)類似AMD 的病理改變，8～11個月齡的Nrf2-/-小鼠70%的眼出現(xiàn)drusen 樣改變，1 年后的小鼠出現(xiàn)RPE 細胞的萎縮，部分病變進展成CNV。且12 月齡的Nrf2-/-小鼠的EGR 的a 波和b 波下降與野生型小鼠比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明基因敲除的小鼠視功能下降。

1.5 阿爾茨海默病5xFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠

光感受器細胞外節(jié)和Bruch 膜中的β 淀粉樣蛋白（amyloid beta，aβ）的含量隨年齡增加而增加。5xFAD 小鼠是一種研究阿爾茨海默病的動物模型，能夠發(fā)生aβ 沉積的病理學(xué)特征，視網(wǎng)膜出現(xiàn)退行性改變，可以作為干性AMD 的小鼠模型。采用透射電鏡對5xFAD 小鼠視網(wǎng)膜RPE 的超微結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)5xFAD 小鼠的RPE 和Bruch 膜的超微結(jié)構(gòu)變化與人類干性AMD 的主要特征相一致，包括RPE 的頂端微絨毛和基底內(nèi)陷消失、Bruch 膜厚度增加、RPE 基底部出現(xiàn)層狀及線狀沉積物、脂褐素顆粒及吞噬未消化的光感受器外節(jié)的吞噬體的聚集[14]。

2 具有AMD 特征的自然小鼠

加速衰老小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）是日本京都大學(xué)對AKR/J 系小鼠進行常規(guī)近親培育時發(fā)現(xiàn)，該小鼠在早期就表現(xiàn)出老年期的各種身體功能衰退的跡象[15]。12個品系的SAM 正常生長一段時間后出現(xiàn)的特征性病理表現(xiàn)包括前凸、脫發(fā)、皮損、淀粉樣變和早期死亡[16]。實驗研究[17]發(fā)現(xiàn)，在該小鼠8 個月齡時，可觀察到眼底類似AMD 樣改變，包括Bruch 膜增厚、RPE 基底部出現(xiàn)層狀及線樣沉積物及小面積的CNV 形成；在11 個月齡以上的SAM-P8 系小鼠中，有40%出現(xiàn)了脈絡(luò)膜新生血管；12 個月齡時發(fā)展為脈絡(luò)膜毛細血管萎縮。

3 藥物誘導(dǎo)的動物模型

3.1 碘酸鈉誘導(dǎo)的干性AMD 模型

碘酸鈉（NaIO3）是無機強氧化劑，研究顯示小鼠眶靜脈叢注射NaIO3后，ERG 波形明顯下降；組織學(xué)切片顯示隨注射時間的延長，RPE 層出現(xiàn)色素紊亂、視網(wǎng)膜外核層逐漸變薄，視網(wǎng)膜病變的程度與NaIO3的劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系[18]。注射NaIO33 d 時視網(wǎng)膜細胞凋亡達到最高峰，且后極部視網(wǎng)膜的損害程度比周邊視網(wǎng)膜重。當NaIO3的注射劑量大于20 mg/kg時視網(wǎng)膜光感受器細胞的形態(tài)和功能會發(fā)生改變，出現(xiàn)類似drusen 樣沉積物及RPE 特異性蛋白減少[19]。實驗[20]證明碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE 凋亡受時間及劑量影響，注射劑量為30～40 mg/kg的小鼠模型適用于研究AMD 的早期病理改變；40～75 mg/kg的劑量會導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生不可逆的損害，不適合做AMD 模型研究[21]。

3.2 聚乙二醇處理動物模型

視網(wǎng)膜下注射0.5 mg 聚乙二醇 （polyethylene glycol，PEG）第5 d 導(dǎo)致小鼠外核層（ONL）厚度減少32%，光感受器內(nèi)外段長度減少61%，ONL 核密度減少49%，RPE 細胞密度增加31%。同時檢測到ONL 層中凋亡陽性細胞數(shù)達最大水平（6.80±1.99）%。在PEG 注射的眼中發(fā)現(xiàn)RPE 細胞變性，與對照組相比，注射PEG 的小鼠視網(wǎng)膜中存在多種炎癥因子表達上調(diào)，如C3、基質(zhì)金屬蛋白酶9 等。PEG 注射導(dǎo)致的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)和基因表達的變化與干性AMD 一致[22]。

4 光損傷視網(wǎng)膜模型

光的氧化損傷增加了AMD 的發(fā)生風險。光照可誘發(fā)視紫紅質(zhì)、脂褐素等感光分子產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致感光細胞外節(jié)盤膜的脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)感光細胞凋亡，對視網(wǎng)膜造成損傷。藍光照射大鼠6 h 后RPE 細胞出現(xiàn)空泡狀改變、固縮和壞死[23]。用400 lx 或800 lx 藍光照射小鼠2 h，5 d 后出現(xiàn)視網(wǎng)膜電圖振幅下降和外核層厚度下降[24]。氧化應(yīng)激、自噬參與視網(wǎng)膜的光損傷過程。氧化應(yīng)激形成大量活性氧及脂質(zhì)過氧化物，減少光感受器外節(jié)膜盤的降解，當自噬機制受損，活性氧的產(chǎn)生和清除不平衡導(dǎo)致RPE 細胞氧化應(yīng)激加重，發(fā)生損傷。光照產(chǎn)生的視網(wǎng)膜損傷模型與干性AMD 類似，光感受器外節(jié)最先受累。

5 小結(jié)

盡管小鼠沒有黃斑[25]，但干性AMD 小鼠模型仍然囊括了干性AMD 的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征。在小鼠AMD 模型中，保持了與人類相同的病理學(xué)特征，如脂褐素的聚集，drusen 的形成，RPE 和光感受器的萎縮以及CNV 的形成。小鼠模型是研究干性AMD 發(fā)病機制和評估該疾病新療法的有效工具[26]，對于研究其發(fā)病機理、治療和預(yù)防有重要作用。許多模型顯示一個或多個AMD 的特點，很少有模型能夠呈現(xiàn)出晚期干性AMD 進展為濕性AMD[27]的過程。期待發(fā)現(xiàn)更加接近人類的干性AMD 動物模型，為干性AMD 不同臨床階段的研究提供幫助。