王曉東 迪麗努爾·塔西買買提 迪麗達爾·地里夏提 哈地利亞·哈斯木 帕麗達·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌實驗室，烏魯木齊 830054)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由孢子絲菌屬菌種(Sporothrixspp.)引起的人畜共患真菌性疾病，該病在全球均有發(fā)生，但尚無明確的流行病學數(shù)據(jù)[1-3]，我國東北、新疆等均有感染患者[4-5]。近年來，孢子絲菌屬菌種在免疫低下患者中引起的系統(tǒng)性感染也在不斷增多。孢子絲菌病的發(fā)病機制與病原體毒力和宿主免疫狀態(tài)緊密相關。最近研究顯示DC能夠識別和轉化真菌相關分子標記，調(diào)控炎癥反應，在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用[6-8]。還有研究認為人源性DC對不同感染部位來源的孢子絲菌屬菌種樣本會產(chǎn)生不同的細胞反應，尤其是感染內(nèi)臟和皮膚的菌種，皮膚感染的孢子絲菌刺激未成熟的DC比內(nèi)臟感染孢子絲菌刺激DC更能激活Th1反應[9]。但是目前關于孢子絲菌屬菌種引起的感染與易感宿主的DC免疫反應研究為數(shù)不多。本研究旨在初步探討宿主感染球形孢子絲菌(S.globosa)后的免疫應答表現(xiàn)，為此本研究采用ELISA的方法檢測該菌刺激小鼠DC后能否誘導產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、IFN-γ，為全面認識和探索該菌與宿主的免疫應答作用及促炎機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

實驗細胞：小鼠骨髓源性DC由上海巴斯德研究天然免疫組贈送。實驗真菌菌株：新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌實驗室醫(yī)學真菌菌種庫收集。各種炎癥因子ELISA試劑盒均購自安徽巧伊生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)試劑：RPMI1640( Gibco，11875-093)，烏拉圭胎牛血清( Hyclone， SH30070.03)， pen/ strep( Hyclone，25)，其他試劑：PBS(Gibco，c20012500bt，PH7.2)，0.25%胰酶(Gibco，25200-056，100mL)，DMSO(Sigma，v90090)等。

1.2 真菌培養(yǎng)及菌懸液配置

將球形孢子絲菌轉種在PDA培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)1周，挑取培養(yǎng)好的菌落研磨，洗滌，過濾，離心，收集菌液，血球細胞板計數(shù)，最后用 PBS液將孢子懸液濃度分別稀釋至1×104個/mL、1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL備用。

1.3 DC培養(yǎng)及刺激

DC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃下含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對上述的細胞進行1∶3傳代、完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至第9天收集懸浮細胞。實驗前收集DC細胞混懸液，以1000 r/min離心5 min。棄去上清液并重懸于3 mL含有10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養(yǎng)基中。用血細胞計數(shù)器在光學顯微鏡下計數(shù)，計算細胞懸浮液濃度，最后將細胞懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×106細胞/mL。鋪板：向6孔板的每個孔中加入1 mL上述的1×106細胞/mL濃度的DC懸液。再向每一孔中補充1 mL RMPI l640完全培養(yǎng)基，使6孔板每一孔中的總細胞數(shù)為1×106個，培養(yǎng)液體積為2 mL。將鋪好的6孔板放入5%CO2培養(yǎng)箱中靜置12 h。6孔板從培養(yǎng)箱中取出，更換新鮮完全培養(yǎng)基(2 mL)后，分別加入1 mLPBS陰性對照，1 mL LPS陽性對照(1 ng/mL)和1 mL不同濃度(1×104個/mL～1×107個/mL)的球形孢子絲菌孢子懸液，密封，再次放入CO2培養(yǎng)箱中。分別在6 h、24 h、48 h和72 h收集6孔板中的培養(yǎng)液。將收集的細胞和培養(yǎng)基放入EP管中，以1000 r/min的速度離心5 min，棄去沉淀物，收集上清液，直接用于ELISA測定。

1.4 IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ濃度的測定

DC經(jīng)過上述處理后，取上清液進行ELISA檢測，具體方法按照試劑盒提供的說明書進行操作。實驗中用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，分別在6 h、24 h、48 h、72 h收集細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA法測IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ的含量。同時以球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個/mL～1×107個/mL)劑量依賴性方式刺激DC后檢測炎癥因子的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 球形孢子絲菌能夠誘導DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α，但未產(chǎn)生IFN-γ和IL-4

用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌能夠能誘導DC以時間依賴方式產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。不同時間點分泌量分別為：IL-1β(6 h：21.26±3.03；24 h：24.04±4.25；48 h：24.90±4.31；72 h：27.29±6.09)、IL-6(6 h：44.38±3.73；24 h：101.72±12.28；48 h：133.10±8.67；72 h：180.38±13.84)、TNF-α(6 h：860.36±20.64；24 h：356.03±11.46；48 h：457.43±17.39；72 h：1454.53±19.46)。由圖1可以看出，LPS和S.globosa菌液刺激DC 6 h后即可檢測到IL-1β，LPS組產(chǎn)生IL-1β的量均高于S.globosa組。在S.globosa組中隨著刺激時間的延長IL-1β的產(chǎn)量逐漸增加，刺激72 h時產(chǎn)生的量達到高峰，但在LPS刺激的細胞中未發(fā)現(xiàn)IL-1β的量隨刺激時間長短而顯著變化的現(xiàn)象。PBS組未檢測到IL-1β。IL-6的分泌也顯示了相同的表達規(guī)律(見圖2)。由圖3可見S.globosa組TNF-α的分泌量呈現(xiàn)不規(guī)則表達，在初始刺激6 h內(nèi)分泌量達到較高水平，刺激24 h分泌量反而迅速減少，之后又逐步增加，在72 h時分泌量達到高峰。LPS組的分泌量則較平穩(wěn)。另外結合圖1～3還可觀察到在不同時間點內(nèi)3種細胞因子表達的量TNF-α > IL-6 > IL-1β。

2.2 球形孢子絲菌以劑量依賴性方式誘導DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α

球形孢子絲菌能以劑量依賴和時間依賴方式誘導DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。由圖4，5可以看出，隨著S.globosa菌液濃度劑量的增高和時間的延長，IL-1β、IL-6分泌量也逐漸增加。但低劑量的104個/mLS.globosa產(chǎn)生IL-1β的量未隨時間延長而變化。107個/mLS.globosa在6 h時產(chǎn)生IL-1β的量就明顯高于其他劑量組，并在72 h達到高峰。IL-6的表達量始終高于IL-1β(見圖4,5)。但105個/mLS.globosa濃度在72 h時分泌的IL-6的量未增加反而減少(見圖5)。TNF-α的表達量卻呈現(xiàn)不規(guī)則(見圖6)，S.globosa不同濃度劑量均在刺激6 h釋放出較高水平的TNF-α，但在刺激24 h卻急劇下降，48 h逐步增加，72 h達到高峰。

圖1球形孢子絲菌處理DC后在不同時間對產(chǎn)生IL-1β量的影響圖2球形孢子絲菌處理DC后在不同時間對產(chǎn)生IL-6量的影響圖3球形孢子絲菌處理DC后在不同時間對產(chǎn)生TNF-α量的影響圖4不同時間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生IL-1β含量圖5不同時間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生IL-6含量圖6不同時間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生TNF-α含量

Fig.1Effect on the IL-1β production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.2Effect on the IL-6 production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.3Effect on the TNF-α production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.4Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-1β in different time periodsFig.5Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-6 in different time periodsFig.6Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing TNF-α in different time periods

3 討 論

孢子絲菌病在全球均有發(fā)生，主要分布在熱帶和亞熱帶地域，南美洲最常見，日本和北美洲也是流行地區(qū)[10-15]。我國的長江中下游流域、東北、新疆均有感染的患者。球形孢子絲菌是引起我國孢子絲菌病的主要致病菌種[16-17]。

研究表明，孢子絲菌病的嚴重程度隨宿主免疫狀態(tài)而變化。T細胞介導的細胞免疫在對抗感染中起核心作用[18-23]。然而控制感染的宿主免疫反應機制尚不清楚。Amanda 等[23]研究顯示NLRP3炎癥小體能夠識別S.schenckii，在孢子絲菌感染中具有保護作用，這種保護作用可能與釋放的IL-1β和IL-17有關。

近年來DC在真菌感染中的作用開始受到醫(yī)學家的深入研究，盡管DC與孢子絲菌屬菌種互相作用的機制了解甚少[24]。DC是一類重要的天然免疫細胞和專職抗原呈遞細胞，在激活機體抗病原體免疫應答及維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。DC的體內(nèi)遷移對于其成熟活化及功能調(diào)控至關重要。有研究表明，DC能夠識別提呈的孢子絲菌抗原，并誘導Th1/Th17免疫反應，產(chǎn)生IL-6，IFN-γ，IL-17，TGF-β和IL-23[25]。但是DC遷移紊亂可導致DC在炎癥部位的過度聚集及活化，導致組織過度炎癥，甚至引發(fā)炎癥性疾病的發(fā)生。因此DC在調(diào)節(jié)增強和減弱細胞免疫的促炎和抗炎反應之間的平衡起著關鍵作用。

DC釋放的細胞因子能通過不同途徑啟動細胞免疫，每個信號途徑又通過不同的細胞因子和效應細胞互相調(diào)控特定的免疫反應，最典型的途徑是Th1和Th2，近幾年又報道了新的Th17途徑[26]。還有研究用白念珠菌細胞表面的磷脂甘露聚糖PLM刺激DC及巨噬細胞通過TLR2產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-10[27]。DC成熟的標志是顯著的表型和功能性轉化，包括對抗原呈遞能力的下降，細胞膜表面的MHC-Ⅱ和共同刺激分子表達增加以及細胞因子的分泌。我們的結果顯示用最低劑量的S.globosa菌液就能誘導激活DC釋放IL-1β、IL-6和TNF-α，我們的研究結果與Verdan等[25]刺激申克孢子絲菌結果相一致。其中IL-1β和IL-6分泌量隨著刺激時間的延長呈現(xiàn)規(guī)律的表達，但是TNF-α分泌水平呈現(xiàn)不規(guī)律的表達。最終細胞因子分泌的量是TNF-α > IL-6 > IL-1β。另外我們的研究結果還顯示球形孢子絲菌能以劑量依賴和時間依賴方式誘導DC分泌IL-1β、IL-6。以上研究結果充分說明，DC能夠識別球形孢子絲菌及其抗原，并在體外促進Th1的分化，其分泌的炎癥因子可能在對抗真菌感染中起重要作用。在這里，不同濃度劑量的S.globosa菌液刺激DC分泌的TNF-α都呈現(xiàn)不規(guī)律表達，我們在除外了質(zhì)量控制誤差的情況下，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因需要進一步研究。另外本研究未檢測到IL-4和IFN-γ，傳統(tǒng)認為，產(chǎn)生IFN-γ的Th1細胞反應是對真菌感染的保護性免疫反應，而由IL-4介導的Th2反應則導致對真菌感染的易感性增加，在Verdan[25]的研究中同樣未檢測到Th2路徑分泌的IL-4和IL-5。因此提示DC在孢子絲菌屬菌種感染早期和感染過程中主要發(fā)揮的是天然免疫應答，獲得性免疫應答在感染發(fā)展過程中逐漸形成。