劉文靜 孫宏莉 張小江 楊文航 肖盟 王瑤 楊啟文 竇紅濤 王賀 趙穎 郭莉娜 劉亞麗 張麗 朱任媛 徐英春

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730；北京市侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

醫(yī)學(xué)上重要的酵母菌包括子囊類酵母菌(念珠菌屬、酵母屬、芽裂殖菌屬)和擔(dān)子菌類酵母菌(隱球菌屬、毛孢子菌屬、紅酵母屬、擲孢酵母屬、馬拉色菌屬、pseudozyma屬)。念珠菌是住院患者侵襲性真菌感染的主要病原菌，在血流感染的病原菌中占第四位[1]。近十年念珠菌感染開始從白念珠菌向非白念珠菌，如近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等轉(zhuǎn)變[2]，對抗真菌藥物的耐藥性在逐漸增加。念珠菌血癥病原體的分布和耐藥性在不同地區(qū)存在明顯差異[3]。因此，了解本地區(qū)念珠菌血癥的菌種分布及耐藥性對其診治具有重要意義。除念珠菌外，其他酵母菌分離相對較少，本研究對北京協(xié)和醫(yī)院酵母菌血癥的病原菌分布及耐藥性進(jìn)行了分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象 北京協(xié)和醫(yī)院2014年1月～2018年12月血培養(yǎng)分離出酵母菌同時臨床診斷為酵母菌血癥的患者共206例。

菌株來源 納入藥敏分析的酵母菌為來自患者血培養(yǎng)陽性的第一株菌，剔除了來源于同一患者的重復(fù)菌株。

儀器與試劑 BD BACTEC FX全自動血培養(yǎng)儀和配套血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)， VITEK 2、MALDI-TOF MS、YSTID鑒定卡和ATB Fungus 3酵母樣真菌藥敏試驗(yàn)盒(法國生物梅里埃公司)，沙堡弱和科瑪嘉顯色平板(天津金章有限公司)，ABI3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

菌種鑒定 所有送檢的血培養(yǎng)標(biāo)本均用全自動血培養(yǎng)儀進(jìn)行需氧瓶、厭氧瓶和/或真菌瓶的增菌培養(yǎng)。需氧瓶或厭氧瓶儀器報(bào)陽后，將陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、中國藍(lán)瓊脂平板，同時涂片進(jìn)行革蘭染色進(jìn)行顯微鏡檢，若見到真菌孢子則加種沙堡弱和科瑪嘉顯色平板；若為真菌瓶報(bào)警陽性后，則直接將標(biāo)本轉(zhuǎn)種于以上5種瓊脂平板，35 ℃溫箱孵育24～48 h，肉眼觀察菌落形態(tài)及顏色，進(jìn)行初步鑒定。顯色不典型的菌落用VITEK 2的API酵母菌鑒定卡 (YST鑒定卡)或MALDI-TOF MS進(jìn)行菌種鑒定，兩者均不能給出結(jié)果或菌名罕見的菌株則進(jìn)行ITS測序。

藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照ATB Fungus 3酵母樣真菌藥敏試驗(yàn)盒試劑說明書進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照CLSIM59和CLSIM60對藥敏結(jié)果判讀，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 血培養(yǎng)分離酵母菌菌種分布

血培養(yǎng)共分離非重復(fù)酵母菌206株。排在前3位的為白念珠菌72株(34.95%)、熱帶念珠菌42株(20.39%)和光滑念珠菌39株(18.93%)；少見菌包括季也蒙念珠菌、畢赤酵母菌、葡萄牙念珠菌、釀酒酵母、郎比可念珠菌、尼瓦利亞念珠菌、紅酵母和希木龍念珠菌(見表1)。

表1 酵母菌血流感染各菌種分布情況

2.2 不同血培養(yǎng)瓶酵母菌陽性分離率、陽性報(bào)警時間及菌種分布

真菌瓶、需氧瓶和厭氧瓶酵母菌的陽性檢出率分別為1.32%(79/6003)，0.43%(371/85855)和0.06%(47/77168)，真菌瓶的送檢量逐年增加，但因需氧瓶和厭氧瓶總數(shù)多，需氧瓶和厭氧瓶酵母菌陽性菌株占所有血培養(yǎng)酵母菌陽性總數(shù)的構(gòu)成比為84.10%(見表2)。需氧瓶、厭氧瓶和真菌瓶陽性報(bào)警時間分別為：(41.13±29.49)h、(49.46±24.22)h、(52.00±53.84)h。47份厭氧瓶酵母菌陽性標(biāo)本中，光滑念珠菌占89.36%(42/47)，其他菌種分別為白念珠菌2株、熱帶念珠菌1株、季也蒙念珠菌1株、尼瓦利亞念珠菌1株。需氧瓶和真菌瓶酵母菌陽性標(biāo)本中分離前2位的菌株均為白念珠菌和熱帶念珠菌，所占比率分別為66.31%和54.43%。

表2 血標(biāo)本不同培養(yǎng)瓶酵母菌陽性檢出率

2.3 幾種主要酵母菌陽性報(bào)警時間

陽性報(bào)警時間從長到短依次為：光滑念珠菌(55.36±26.87)h，近平滑念珠菌(52.58±45.94)h，白念珠菌(49.17±35.37)h和熱帶念珠菌(23.38±19.32)h。

2.4 酵母菌血流感染患者年齡和性別分布

我院酵母菌血癥發(fā)生于60歲以上的老年患者87例(42.23%)，男性115例(55.83%)，女性91例(44.17%)，詳見表3。

表3 酵母菌血流感染患者年齡分布

2.5 酵母菌血流感染的科室分布

酵母菌血癥前3位科室為急診科41株(19.90%)，內(nèi)科ICU和外科ICU均為36株(17.48%)(見圖1)。

(續(xù)表)

圖1 酵母菌血流感染的科室分布

2.6 ATB Fungus 3 MIC法藥敏結(jié)果

白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌對氟康唑敏感率分別為98.61%、97.44%、89.66%和71.43%。只有1株熱帶念珠菌對兩性霉素B耐藥。熱帶念珠菌和光滑念珠菌對伏立康唑的敏感性低于伊曲康唑，新生隱球菌對兩性霉素B和伊曲康唑野生型(WT)菌株比率分別為81.82%和90.91%，其他藥物WT菌株比率均為100%(見表4)。5-氟胞嘧啶藥敏結(jié)果僅有2株克柔念珠菌、1株白念珠菌、1株光滑念珠菌和1株紅酵母的MIC≥16 μg/mL，其余均≤4 μg/mL。幾株少見酵母菌種體外藥敏的分布(見表5)。郎比可念珠菌對氟康唑及紅酵母對5-氟胞嘧啶的MIC高于ATB Fungus 3檢測最高值。

3 討 論

近年來隨著抗真菌藥物的使用及其他因素的影響，酵母菌的臨床分布開始出現(xiàn)了從白念株菌向非白念株菌轉(zhuǎn)變，不同的酵母菌的毒力不同，可以分為3組。第一組為白念珠菌和熱帶念珠菌，第二組為光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和釀酒酵母，第三組為克柔念珠菌、近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌，3組念珠菌的毒力逐漸下降，念珠菌的毒力與其分布和耐藥性相關(guān)[4]。本研究分離前3位的為白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌，可能與此理論高度相關(guān)。不同區(qū)域血流感染酵母菌分布不同，在中國、日本等亞洲國家以白念珠菌為主，巴基斯坦和印度則以熱帶念珠菌為主[5]，而在中國大陸少數(shù)地區(qū)則以非白念為主[6]。

表4 血流感染常見酵母菌對抗真菌藥物的敏感性(S%，WT%)

*：流行病學(xué)折點(diǎn)，為WT(野生型)菌株的比率；“—”無判定折點(diǎn)

表5 少見酵母菌種體外藥敏結(jié)果(μg/mL)

不同血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測念珠菌的敏感率為50%，厭氧瓶對念珠菌的檢出能力較需氧瓶差，光滑念珠菌除外[7]，本研究厭氧瓶念珠菌陽性菌株中光滑念珠菌占89.36%。陽性報(bào)警時間為從血培養(yǎng)瓶放入血培養(yǎng)儀開始，至儀器出現(xiàn)陽性報(bào)警信號的時間。念珠菌陽性報(bào)警時間與標(biāo)本中的菌濃度成正相關(guān)，與不同念珠菌具有不同的繁殖方式、繁殖周期等相關(guān)[8]，且與標(biāo)本送檢時間、血液中細(xì)胞等成分不同，是否使用抗菌藥物等相關(guān)[7]。本研究陽性報(bào)警時間光滑念珠菌最長，熱帶念珠菌最短，白念珠菌與近平滑念珠菌居中，整體均值與國內(nèi)相關(guān)調(diào)查結(jié)果基本一致[9]。使用抗真菌藥物前，由于真菌瓶含有適于真菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，陽性報(bào)警時間較需氧瓶和厭氧瓶短，且念珠菌陽性檢出率比需氧瓶和厭氧瓶高。體外實(shí)驗(yàn)表明使用抗真菌藥物后，各種血培養(yǎng)瓶的陽性報(bào)警時間均延長。使用不同的抗真菌藥物念珠菌陽性檢出不同[10]。本研究真菌瓶念珠菌的陽性檢出率高于需氧瓶和厭氧瓶(分別為1.32%、0.43%、0.06%)，與文獻(xiàn)描述一致。但需氧瓶、厭氧瓶和真菌瓶的陽性報(bào)警時間依次延長，可能與上述使用抗真菌藥物等情況有關(guān)。

酵母菌血流感染患者主要在60歲以上老年人群且男性發(fā)病率高于女性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。研究指出老年人真菌血癥的發(fā)生率高，抗真菌藥物的使用比真菌易感基因更相關(guān)[1]。酵母菌血流感染主要分布于急診科、內(nèi)科ICU和外科ICU，與進(jìn)行有創(chuàng)性操作、留置導(dǎo)管和和入住ICU等高危因素密切相關(guān)[11]。

氟康唑副作用相對少，費(fèi)用相對低，是臨床上酵母菌血流感染的首選藥物。但對氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌、粘紅酵母菌等，則要避免使用其進(jìn)行治療。本研究白念珠菌和近平滑念珠菌對氟康唑敏感率在90%以上，與CHIF-NET中國多中心近5年(2009-2014年)侵襲性念珠菌感染數(shù)據(jù)基本一致[12]；光滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑非敏感率(均為2.56%)，低于CHIF-NET和亞太地區(qū)數(shù)據(jù)6.8%～24.0%和3.9%～10%[12]。光滑念珠菌對伏立康唑的非野生型(NWT)菌株的比率為15.38%，在文獻(xiàn)描述范圍內(nèi)(5%～17.8%)[5]。熱帶念珠菌對氟康唑(28.57%)和伏立康唑(26.19%)耐藥率較高，且高于CHIF-NET數(shù)據(jù)21.0%和21.4%[12]，與亞太地區(qū)熱帶念珠菌對唑類的耐藥率高一致，但歐美地區(qū)較低<10%。氟康唑耐藥率增高與其廣泛使用有關(guān)。治療和預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)光滑念珠菌、釀酒酵母氟康唑耐藥菌株主要發(fā)生在7天抗真菌藥預(yù)防性治療(主要是氟康唑)的患者[3]。熱帶念珠菌和光滑念珠菌對唑類藥物易產(chǎn)生交叉耐藥，本研究伏立康唑的耐藥率高于伊曲康唑，具體機(jī)制尚需進(jìn)步研究，由于唑類藥物的耐藥率增高，棘白菌素類藥物開始做為一線藥物使用?？拐婢幬镏袃尚悦顾谺是最敏感的藥物，臨床為了減少對患者的毒性反應(yīng)增可加選用兩性霉素B脂質(zhì)體。5-氟胞嘧啶單藥使用易產(chǎn)生耐藥性，可聯(lián)合其他抗菌藥物治療常見酵母菌所致全身感染。

酵母菌血流感染的準(zhǔn)確及時診斷關(guān)乎患者的治療及預(yù)后，需要使用合理的培養(yǎng)系統(tǒng)和檢測方法，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果及時調(diào)整劑量或更改方案。