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85株皮膚癬菌感染的病原菌分析及標(biāo)準(zhǔn)化體外藥物敏感性研究

2020-01-10 06:43:36劉潔劉曉云于波胡小平
中國真菌學(xué)雜志 2019年6期
關(guān)鍵詞:特比皮膚癬伏立康

劉潔 劉曉云 于波 胡小平

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚性病科,深圳 518036)

皮膚癬菌是最常見的引起頭癬、體癬、手足癬等淺部真菌感染的絲狀真菌,在免疫受損的患者甚至可導(dǎo)致深部感染[1]。臨床上治療皮膚癬菌感染的藥物主要包括烯丙胺類、唑類、環(huán)丙酮類和多烯類等。本研究旨在精確分析本地區(qū)皮膚癬菌感染的病原菌特點(diǎn),采用標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏方案測定體外藥物敏感性,以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與菌株分離鑒定

2018年6月~2019年1月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科就診的患者,入組標(biāo)準(zhǔn)為臨床表現(xiàn)符合體癬、股癬、手足癬、甲癬、頭癬等特征,采樣前3個(gè)月患者未接受過局部或全身抗真菌治療,共納入161例疑似皮膚癬菌感染的患者。對(duì)入組的161例患者的皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))同時(shí)做KOH涂片直接鏡檢和真菌分離培養(yǎng)。共有109例患者在皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))中檢出透明分隔的關(guān)節(jié)菌絲或關(guān)節(jié)孢子(皮膚癬菌鏡檢陽性率67.7%)。真菌分離培養(yǎng)皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))接種于含放線菌酮150 μg·mL-1的沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar, SDA)置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察4周。在109例KOH直接鏡檢皮膚癬菌為陽性的標(biāo)本培養(yǎng)出85例皮膚癬菌,6例念珠菌等酵母樣菌落,2例青霉;在52例KOH直接鏡檢陰性的標(biāo)本培養(yǎng)出7例念珠菌等酵母樣菌落,5例青霉,1例曲霉。余培養(yǎng)未見真菌生長。

分子生物學(xué)方法為利用通用引物擴(kuò)增測序內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)鑒定85例培養(yǎng)陽性的皮膚癬菌。將受試菌株置于SDA培養(yǎng)基28℃生化培養(yǎng)箱孵育7 d,使用Biospin真菌全基因組DNA試劑盒(博日科技有限公司)提取全基因組DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增核糖體的ITS基因序列,引物為真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR體系包括約80 ng的DNA模板,2XTaqPCR GreenMix 25 μL(天根生化科技有限公司),10 μmol·L-1上下游引物各2 μL,ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化和基因測序。各菌株序列區(qū)段在荷蘭皇家科學(xué)院CBS真菌生物多樣性研究中心網(wǎng)站(http://www.cbs.knaw.nl/dermatophytes/)進(jìn)行比對(duì),依據(jù)目前比較公認(rèn)的ITS區(qū)基因序列中堿基比對(duì)相似性大于98%判定其為同一菌種進(jìn)行鑒定[2]。并以CBS數(shù)據(jù)庫中已確證分類的皮膚癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS區(qū)序列作為參考序列。

1.2 體外藥物敏感性測定

受試菌株為經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定得到的85株皮膚癬菌,質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC-22019和趾間毛癬菌ATCC-MYA-4439(均購自廣東省微生物菌種保藏中心)。藥敏測定藥物均以原料粉形式由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供,兩性霉素B(批號(hào)00620A,純度>75%);伊曲康唑(批號(hào)N0803A,純度>99%);氟康唑 (批號(hào)M0801A ,純度為>98.5% );特比萘芬(批號(hào)D0102A,純度>98.5%);環(huán)吡酮胺(批號(hào)M0523A,純度>99%);酮康唑(批號(hào)J0620AS,純度>99%);伏立康唑(批號(hào)S0601A,純度>99%)。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)制定的M38-A2方案進(jìn)行。按照CLSI方案采用RPMI-1640液體培養(yǎng)基。

藥物儲(chǔ)存液制備與儲(chǔ)存 將抗真菌藥物按照溶解性分別采用二甲基亞砜(DMSO)或蒸餾水溶解,獲得相應(yīng)濃度(包括各藥的折點(diǎn)和質(zhì)控菌株對(duì)該藥物MIC范圍)的儲(chǔ)存液。新鮮配制的儲(chǔ)存液分裝到無菌的聚丙乙烯小管,密封儲(chǔ)存于-80℃。

藥敏板配制 實(shí)驗(yàn)前采用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋至2倍終濃度工作液。特比萘芬和伏立康唑的最終濃度為0.001~0.5 μg·mL-1,氟康唑最終濃度范圍為0.125~64 μg·mL-1,環(huán)吡酮胺最終濃度為0.015~8 μg·mL-1,兩性霉素B、伊曲康唑和酮康唑最終濃度為0.03~16 μg·mL-1。將稀釋的藥物按照濃度由高到低依次加入微量藥敏板(96孔酶標(biāo)板)1~10列中,每孔100 μL,第11、12列分別加入100 μL、200 μL相應(yīng)液體培養(yǎng)基,分別作為生長對(duì)照和空白對(duì)照,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液制備及接種 將受試臨床分離菌株轉(zhuǎn)種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落,制成菌懸液,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液終濃度至(1~5)×103CFU·mL-1,將此濃度菌懸液1至11列每孔各加入100 μL。

孵育與結(jié)果判讀 將接種后的藥敏培養(yǎng)板35℃培養(yǎng)4~5 d后觀察結(jié)果。目前國內(nèi)對(duì)絲狀真菌的藥敏試驗(yàn)主要參考CLSI M38-A2方案,皮膚癬菌體外藥敏尚無臨床折點(diǎn)或流行病學(xué)臨界值進(jìn)行分析,因此本研究僅讀取和比較測試藥物對(duì)皮膚癬菌的MIC值。兩性霉素B的MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長對(duì)照相比無任何肉眼可辨生長(100%受抑)的最低藥物濃度;唑類藥物、環(huán)吡酮胺和特比萘芬 MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長對(duì)照相比生長明顯抑制(80%受抑)的最低藥物濃度。所有試驗(yàn)均重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理

記錄抗真菌藥物對(duì)受試菌株的MIC值,計(jì)算MIC范圍,MIC幾何均數(shù)(geometric mean MIC, GM MIC),MIC90和MIC50。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

161例疑似皮膚癬菌感染的患者中有109例行KOH涂片直接鏡檢在皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))標(biāo)本中檢出透明分隔的關(guān)節(jié)菌絲或關(guān)節(jié)孢子(鏡檢陽性率為67.7%)?;颊呋疾〔课缓湍挲g性別分布情況見表1,包括男性61例(55.3%),女性48例(44.7%),年齡范圍1~65歲,平均年齡為31.5歲。161例疑診為皮膚癬菌感染的患者的皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))標(biāo)本在SDA培養(yǎng)基28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周。在109例KOH直接鏡檢為陽性的標(biāo)本培養(yǎng)出85例皮膚癬菌(培養(yǎng)陽性率為52.8%),6例念珠菌等酵母樣菌落,2例青霉,16例未見真菌生長;在52例KOH直接鏡檢為陰性的標(biāo)本培養(yǎng)出7例念珠菌等酵母樣菌落,5例青霉,1例曲霉,39例未見真菌生長。85例皮膚癬菌培養(yǎng)陽性的菌株運(yùn)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定的結(jié)果(見表2)為68株紅色毛癬菌(80%)、7株犬小孢子菌(8.2%)、5株趾間毛癬菌(5.9%)、3株石膏樣小孢子菌(3.5%)、紫色毛癬菌(1.2%)和斷發(fā)毛癬菌(1.2%)各1株。85例皮膚癬菌培養(yǎng)陽性的患者中,紅色毛癬菌是引起手足癬、甲癬、股癬和體癬的主要致病菌,犬小孢子菌是引起頭癬的主要致病菌。

2.2 體外藥物敏感性測定

7種抗真菌藥物對(duì)6種皮膚癬菌的體外藥物敏感性測定結(jié)果(見表3)顯示,特比萘芬相較于本研究中的其他藥物,對(duì)紅色毛癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和斷發(fā)毛癬菌的測定值GM MIC均為最低(分別為0.032 μg·mL-1、 0.040 μg·mL-1、 0.003 μg·mL-1、 0.064 μg·mL-1)。伏立康唑相較于本研究中的其他藥物對(duì)趾間毛癬菌的體外抑菌濃度值最低(0.040 μg·mL-1),伊曲康唑和特比萘芬相較于本研究中的其他藥物對(duì)紫色毛癬菌的體外最低抑菌濃度值均最低(0.030 μg·mL-1)。7種抗真菌藥物對(duì)分離到的皮膚癬菌臨床分離菌株的GM MIC值從低到高依次為:特比萘芬(0.032 μg·mL-1)、伏立康唑(0.041 μg·mL-1)、伊曲康唑(0.370 μg·mL-1)、酮康唑(0.628 μg·mL-1)、環(huán)吡酮胺(0.922 μg·mL-1)、兩性霉素B(1.763 μg·mL-1)、氟康唑(9.181 μg·mL-1)。

表1109株KOH真菌鏡檢皮膚癬菌陽性的患者的感染部位、年齡和性別分布 (n)

Tab.1Infection type, age and gender distribution of 109 strains of dermatophytes (n)

部位年齡組性別<3030~50>50男性女性總計(jì)體癬710211819股癬79316319手足癬9175161531甲癬13161111930頭癬10007310總計(jì)4652116148109

表285株皮膚癬菌培養(yǎng)陽性的菌種分布 (n)

Tab.2The distribution of 85isolates of dermatophytes cultured positive (n)

感染類型紅色毛癬菌犬小孢子菌石膏樣小孢子菌趾間毛癬菌紫色毛癬菌斷發(fā)毛癬菌總計(jì)體癬141100016股癬150000015手足癬180000018甲癬210050026頭癬06201110總計(jì)687351185

3 討 論

皮膚癬菌及其主要致病菌種的分布在不同國家和地區(qū)具有差異性。皮膚癬菌感染的主要流行菌種有紅色毛癬菌、須癬毛癬菌復(fù)合體、紫色毛癬菌、絮狀表皮癬菌和犬小孢子菌等。國外文獻(xiàn)報(bào)道利比亞[3]主要流行紫色毛癬菌,伊朗[4-5]和伊拉克[6]主要為絮狀表皮癬菌,澳大利亞主要為趾間毛癬菌[7],而在泰國主要為犬小孢子菌[8]。本研究中,紅色毛癬菌是我院皮膚癬菌感染中最主要的菌種,該結(jié)果同我國其他地區(qū)及國外大多數(shù)國家相一致[9-13]。

目前,診斷皮膚癬菌感染主要基于真菌直接鏡檢和真菌培養(yǎng)。真菌直接鏡檢是臨床上診斷皮膚癬菌感染的重要手段,但其局限性在于無法準(zhǔn)確地鑒定菌株。真菌直接鏡檢的同時(shí)還要進(jìn)行真菌培養(yǎng),通常是將皮膚刮屑(或甲板刮屑、毛發(fā))接種在添加放線菌酮或氯霉素的SDA培養(yǎng)基上置于28℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),依據(jù)菌落形態(tài)、顏色變化及鏡下形態(tài)等特征判定結(jié)果。然而,單純真菌培養(yǎng)形態(tài)學(xué)鑒定目前存在諸多問題,包括不能精準(zhǔn)地鑒定菌種,培養(yǎng)周期較長,來自多種非皮膚癬菌絲狀真菌(non-dermatophyte filamentous fungi, NDF)菌落的干擾(如鐮刀菌屬、曲霉屬、青霉屬和鏈格孢屬等)等。因此,近年來多種分子生物學(xué)方法用來精準(zhǔn)鑒定皮膚癬菌菌種,如使用通用引物PCR擴(kuò)增測序受試菌株的ITS區(qū)并和標(biāo)準(zhǔn)株序列進(jìn)行比對(duì)[2]、使用單項(xiàng)引物(GACA)4的PCR[14]、多重引物PCR(multiplex PCR)[15]、任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(arbitrarily primed PCR, AP-PCR)[16]、巢式PCR(nested PCR)[17]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)[18]和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA (randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)[19]等。其中,皮膚癬菌的rDNA是一種串聯(lián)重復(fù)基因,在rDNA各亞基間有高度重復(fù)序列的ITS區(qū),ITS序列擴(kuò)增測序分析是目前公認(rèn)的進(jìn)行真菌菌種鑒定最可靠的方法之一。此外,皮膚癬菌的鑒定還有基于完整細(xì)胞指紋圖譜技術(shù)的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[20-21],該技術(shù)在皮膚癬菌的鑒定中顯示出較好的效果。

表3 7種抗菌藥物對(duì)85株皮膚癬菌臨床分離株的最低抑菌濃度(MICs)(μg·mL-1)

注:1. GM:幾何均數(shù);2. MIC50: 抑制50%試驗(yàn)菌株生長所需的MIC值;3. MIC90: 抑制90%試驗(yàn)菌株生長所需的MIC值.

本研究中7種測試藥物對(duì)6種皮膚癬菌表現(xiàn)出不同的抗真菌特點(diǎn)。其中,特比萘芬對(duì)6種皮膚癬菌受試菌株的體外抗真菌活性最強(qiáng),氟康唑?qū)?種皮膚癬菌受試菌株的體外抗真菌活性最弱,國內(nèi)吳等[22]和卜等[23]以及國外多數(shù)研究結(jié)果[24,25]均顯示特比萘芬具有最強(qiáng)的體外抗真菌活性。而國外已有關(guān)于皮膚癬菌對(duì)特比萘芬耐藥的報(bào)道[26-29],因此臨床和科研人員需重視特比萘芬的藥物敏感性監(jiān)測。此外,伏立康唑在唑類藥物中對(duì)皮膚癬菌的體外抗真菌活性最強(qiáng)。國內(nèi)鄧等[30]對(duì)紅色毛癬菌進(jìn)行的體外藥敏測定表明新一代三唑類藥物相較于第一代唑類藥物表現(xiàn)出更好的抗真菌活性,但國內(nèi)尚缺乏伏立康唑?qū)Τt色毛癬菌以外的皮膚癬菌的體外藥物敏感性的相關(guān)研究。伏立康唑是新一代三唑類抗真菌藥物,是在氟康唑的基礎(chǔ)上進(jìn)行了分子改造。目前伏立康唑被批準(zhǔn)用于嚴(yán)重侵襲性曲霉病、對(duì)氟康唑耐藥的念珠菌引起的嚴(yán)重侵襲性感染以及足放線菌屬和鐮刀菌屬引起的嚴(yán)重感染,而適應(yīng)癥尚未包括皮膚癬菌感染。在臨床應(yīng)用方面,已有報(bào)道伏立康唑成功治療了1例紅色毛癬菌引起的頑固性面部Majocchi肉芽腫[31]。伊曲康唑、酮康唑、環(huán)吡酮胺的體外抗真菌活性同國內(nèi)吳等[22]和國外相關(guān)報(bào)道[25]結(jié)果相似。

綜上,紅色毛癬菌是我院就診患者皮膚癬菌感染的主要致病菌。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于皮膚癬菌的菌種鑒定,具有快速、精準(zhǔn)、可鑒定到種等優(yōu)點(diǎn),對(duì)于皮膚癬菌的臨床診斷、防治及流行病學(xué)檢測具有重要價(jià)值。皮膚癬菌感染的用藥選擇和皮膚癬菌感染的部位、程度以及菌種類型有關(guān),體外藥物敏感性試驗(yàn)在預(yù)測藥物抗真菌活性方面具有重要作用,而目前我院所在的深圳地區(qū)對(duì)皮膚癬菌的藥物敏感性測定尚未廣泛開展。特比萘芬對(duì)本地區(qū)6種皮膚癬菌具有良好的體外抗真菌活性,在唑類藥物中伏立康唑體外MIC值較低。本研究結(jié)果可為臨床合理用藥提供參考,但仍需進(jìn)行多中心大樣本量的藥物敏感性試驗(yàn)以及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和藥代學(xué)相關(guān)研究,從而更好地評(píng)價(jià)抗真菌藥在患者體內(nèi)的療效。

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