王影 項明潔 劉錦燕 葉書來 周馨

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)檢驗科，合肥 230036；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

念珠菌(Candidaspp.)是臨床上真菌感染的主要致病菌。近年來，隨著器官移植、腫瘤放化療、大劑量廣譜抗生素的長期應(yīng)用，糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用及臨床預(yù)防性或過量抗真菌藥物的應(yīng)用等因素[1, 2]，臨床真菌感染問題日趨嚴重，可導(dǎo)致口腔、上呼吸道、陰道黏膜及全身系統(tǒng)性侵襲性感染(invasive fungual infection，IFI)。其中侵襲性真菌感染預(yù)后差，病死率高，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[1]。雖然在臨床念珠菌的感染中白念珠菌最常見，但是由非白念珠菌(non-albicansCandida，NAC)引起的感染，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[3]，其中，以熱帶念珠菌較常見[2, 4]。研究顯示，熱帶念珠菌已成為住院患者血流和尿路真菌感染的重要病原體[5]。抗真菌藥物中三唑類藥物，尤其是氟康唑因抗菌譜廣、療效顯著、生物利用度高和毒副作用低等優(yōu)點，常作為臨床一線用藥[6, 7]，但由于唑類藥物僅具有抑菌而非殺菌效果，在臨床長期、反復(fù)用藥過程中易導(dǎo)致耐藥發(fā)生，使得臨床治療變得棘手[1, 8]。

熱帶念珠菌耐藥機制至今仍不太明確，有研究報道熱帶念珠菌唑類藥物的耐藥與ERG11基因有關(guān)。ERG11基因的編碼產(chǎn)物14α-去甲基化酶(14α-demethylase，14-DM)為念珠菌細胞膜麥角固醇合成通路中關(guān)鍵酶，是唑類藥物的作用靶酶[9]。本研究旨探討臨床唑類藥物耐藥熱帶念珠菌ERG11基因的改變。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株來源 本研究所用的臨床熱帶念珠菌均來自于瑞金醫(yī)院2012年至2015年的住院及門急診的患者。

儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)；實時熒光定量PCR分析儀(ABI 7300，美國)； Tanon EPS-300 水平式電泳儀和Tanon 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；PCR儀(S100TMThermal Cycler PCR，Bio-Rad 美國)；YPD 培養(yǎng)基(上海博微生物科技有限公司)；Ex Taq 酶(TaKaRa 公司)；DNA Marker DL2000 (TaKaRa 公司)；酵母菌RNA抽提試劑盒、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR擴增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，本研究所用引物由生工生物工程有限公司進行合成。

1.2 方法

菌株鑒定 -80℃ 25%甘油凍存的臨床菌株接種于科瑪嘉酵母菌顯色平板，于35℃培養(yǎng)24～48 h后，熱帶念珠菌呈深藍綠色。再用VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對臨床分離的菌株進行進一步鑒定。將最終鑒定成功的菌落取單克隆增菌培養(yǎng)后，置于-80 ℃ 25%甘油培養(yǎng)液中凍存待用。

藥敏 以白念珠菌ATCC 90028為陰性對照，克柔念珠菌ATCC 6258為陽性對照，采用微量肉湯稀釋法檢測菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。具體檢測方法按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案進行。

DNA提取 熱帶念珠菌經(jīng)YPD 培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)過夜， 收集菌體，加酵母菌裂解液(10%SDS、0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA 蛋白酶K) 后，65 ℃水浴2 h 破壁，用苯酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提1 次，異丙醇沉淀，后用75%乙醇洗滌，加水溶解，-20 ℃凍存。

ERG11基因測序 由于熱帶念珠菌ERG11基因編碼區(qū)全長為1587bp(熱帶念珠菌標準菌株ATCC750，GenBank數(shù)據(jù)庫編號M23673)，為保證測序結(jié)果的準確性，設(shè)計3對引物進行基因全長進行測序，具體引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系包括Ex Taq酶0.25 μL，10×Ex buffer 5 μL(含20 mmol/L Mg2+)，dNTPs 4 μL，50 μmol/L的正向和反向引物各0.4 μL，DNA模板(200 ng/μL)1 μL和雙蒸水ddH2O 38.95 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 2 min；94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72℃ 1 min,共29個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物與6×loading buffer 混勻后加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳孔，在Tanon EPS-300水平式電泳儀中電泳20 min，經(jīng)Tanon凝膠成像系統(tǒng)證實為單一條帶后，送生工生物工程有限公司測序，測序引物與擴增引物相同，測序方法為sanger法，由于熱帶念珠菌為二倍體菌株，所有基因測序均采用正反雙向引物同時測序。

表1 ERG11基因擴增及測序引物

實時熒光定量PCR檢測 參照酵母菌RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對臨床熱帶念珠菌株進行RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄。按照SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR擴增試劑盒說明書配制RT-PCR反應(yīng)體系，引物為ERG11-F和ERG11-R，反應(yīng)條件為：95 ℃ 2min；95 ℃ 5 s、 60 ℃ 31 s，40 個循環(huán)。收集熒光閾值(Cycle threshold，Ct)，以熱帶念珠菌ACT為內(nèi)參基因，用相對定量方式計算△Ct (△Ct = CtERG11-CtACT)，各唑類耐藥菌株ERG11表達量相對于敏感菌株平均ERG11表達量的倍數(shù)即為2-△△Ct(△△Ct=△Ct耐藥-△Ct敏感)。每個標本同時檢測3次，達到2倍及以上增高為有意義。

2 結(jié) 果

對臨床連續(xù)收集的92株熱帶念珠菌進行藥敏檢測，氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑的耐藥折點分別為培養(yǎng)24 h后≥8 mg/L, ≥1 mg/L 及≥1 mg/L，結(jié)果顯示有29株臨床菌株對至少一種唑類藥物耐藥(見表2)，耐藥率為31.52%。ERG11基因測序結(jié)果顯示，40株臨床菌株，共發(fā)現(xiàn)2個錯義突變(S154F、Y132F)，5個同義突變。其中，29株唑類藥物耐藥菌株中有24株(82.76%)同時出現(xiàn)錯義突變S154F、Y132F，而11株唑類藥物敏感菌株無錯義突變出現(xiàn)。以熱帶念珠菌ACT為內(nèi)參基因，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(見圖1)，與唑類藥物敏感菌株ERG11基因平均表達量相比，29株唑類藥物耐藥菌株中有19株ERG11基因表達量上調(diào)兩倍以上。 分析16株唑類藥物全耐藥菌株及其余13株僅對一種或兩種藥物耐藥菌株的ERG11表達水平，顯示前者ERG11基因表達水平高于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016<0.05)，見圖2。

3 討 論

熱帶念珠菌是一種臨床常見的條件致病性真菌，其臨床治療的主要藥物為三唑類藥物，如氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。近年來，熱帶念珠菌耐唑類藥物的報道日漸增多，但其耐藥機制仍不甚明確[1]。少量已報道的對熱帶念珠菌耐藥機制的研究主要是依據(jù)白念珠菌及光滑念珠菌唑類藥物耐藥的分子機制，如多藥耐藥蛋白(multidrug resistant protein, MRP)表達增加；唑類藥物作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)表達增加或結(jié)構(gòu)改變；菌株生物膜形成及細胞代謝應(yīng)激反應(yīng)等。有研究顯示[10-12]，臨床熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥可能與ERG11基因突變及過表達有關(guān)而與多藥耐藥蛋白無關(guān)。也有研究認為熱帶念珠菌耐藥受MDR1基因過表達及ERG11的突變兩種機制共同調(diào)控[13]。

ERG11基因編碼產(chǎn)物羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)為唑類藥物抗真菌作用靶酶，其基因突變與多種真菌唑類藥物耐藥相關(guān)，如白念珠菌[14]、近平滑念珠菌[15]、新生隱球菌[16]等。本研究共收集92株臨床熱帶念珠菌，其中有29株對至少一種唑類藥物耐藥，耐藥率高達31.52%。菌株ERG11基因測序顯示，24株耐藥菌株同時出現(xiàn)S154F、Y132F錯義突變，推測可能是這兩種錯義突變產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，使ERG11基因編碼產(chǎn)物，即藥物作用靶酶產(chǎn)生明顯改變，進一步降低藥物與靶酶的親和力。值得注意的是CaERG11基因的Y132H/F錯義突與白念珠菌唑類藥物耐藥有關(guān)[14]，CpERG11基因Y132F氨基酸置換與近平滑念珠菌唑類耐藥相關(guān)[15,17]，這說明氨基酸132位點的置換是念珠菌屬的熱門位點，可能此位點在基因編碼過程中產(chǎn)生非常重要的作用[11]。最新研究又發(fā)現(xiàn)新的熱帶念珠菌ERG11基因錯義突變K143R、V125A、Y257H及G464S，并證實與唑類藥物耐藥相關(guān)[18,19]。ERG11基因表達量檢測結(jié)果顯示，與唑類藥物敏感菌株ERG11基因平均表達量相比，29株藥物耐藥菌株有19株呈現(xiàn)不同程度的ERG11表達量上調(diào)，而且耐藥菌株ERG11基因表達量與其唑類藥物耐藥數(shù)量有相關(guān)趨勢，三種唑類藥物全耐藥菌株與非全耐藥菌株相比，ERG11基因表達水平增高，這與Jiang 等[11]的研究結(jié)果較一致。本研究有4株(CT08、CT13、CT16和CT20)唑類藥物耐藥菌株無ERG11基因錯義突變及明顯的ERG11基因表達上調(diào)，這說明還有其他耐藥機制參與菌株耐藥，這些耐藥機制還需在以后的研究中繼續(xù)探討。

表2 臨床菌株藥敏結(jié)果及ERG11基因核苷酸和氨基酸突變位點

注：下劃線指錯義突變位點

圖129株唑類藥物耐藥菌株ERG11基因表達水平圖2三種唑類藥物全耐藥菌株與非全耐藥菌株ERG11基因表達水平

Fig.1The expression ofERG11 gene in 29 azole-resistant clinical isolatesFig.2The expression levels ofERG11gene in isolates which were resistant to three azole antifungals and were resistant to only one or two azole antifungals

綜上所述，熱帶念珠菌作為一種臨床上分離率高，且近幾年唑類藥物耐藥率逐漸上升的條件致病菌, 國內(nèi)對其研究程度遠低于白念珠菌, 我們應(yīng)在后續(xù)的研究中對其予以重視，闡明其耐藥機制，為臨床治療及新藥研發(fā)提供思路。