賀 丹，楊 迪，王家敏，柏家林*

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030 2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，甘肅 蘭州 730030 3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細(xì)胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells,MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國(guó)Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織分離培育建立[1]，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認(rèn)的適于流感病毒復(fù)制的3種細(xì)胞系之一。目前，MDCK細(xì)胞被用于分離流感病毒，分離菌株的抗原性和基因特征相對(duì)穩(wěn)定，更接近原始標(biāo)本[2]。流感(Influenza)，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發(fā)流行及散發(fā)。其中，甲型流感病毒由于其抗原性而易于突變，具有高度傳染性，容易導(dǎo)致人畜死亡[3-4]。目前，國(guó)際上已有企業(yè)已批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗。

2005年11月16日疫苗和相關(guān)生物制品顧問(wèn)委員會(huì)（VRBPAC）組織召開(kāi)的會(huì)議討論了MDCK細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)用于流感疫苗生產(chǎn)的相關(guān)事宜，并且著重討論了MDCK細(xì)胞的成瘤性問(wèn)題。會(huì)議期間諾華公司、荷蘭蘇威制藥公司、美國(guó)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)公司分別做了MDCK細(xì)胞的研究報(bào)告[5]。諾華公司的研究報(bào)告顯示無(wú)血清懸浮培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞的成瘤性非常強(qiáng)，10個(gè)細(xì)胞就可以對(duì)裸鼠成瘤，但是對(duì)該公司通過(guò)馴化獲得的MDCK細(xì)胞株33016-PF的研究顯示該細(xì)胞株對(duì)裸鼠不成瘤。荷蘭蘇威制藥公司的研究報(bào)告顯示MDCK細(xì)胞（CCL-34）母細(xì)胞（P56）接種的細(xì)胞量高于107細(xì)胞對(duì)裸鼠成瘤，建立的細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞傳代至P98代時(shí)接種105細(xì)胞量就對(duì)裸鼠形成腫瘤。美國(guó)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)公司生產(chǎn)流感疫苗使用的細(xì)胞是該公司自主研發(fā)獲得的無(wú)成瘤性MDCK貼壁細(xì)胞株，接種107細(xì)胞量對(duì)裸鼠不成瘤。

目前，獲得無(wú)成瘤性MDCK細(xì)胞株仍是各國(guó)科研人員研究的重點(diǎn)。本研究使用單克隆技術(shù)建立了弱成瘤MDCK-CL35、較弱成瘤MDCK-CL09細(xì)胞株。運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)獲得高成瘤性和單克隆細(xì)胞株低成瘤性MDCK細(xì)胞差異表達(dá)的基因（DEGs），發(fā)現(xiàn)了降低單克隆細(xì)胞致腫瘤性的潛在分子機(jī)制，為建立MDCK低成瘤的細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)三株細(xì)胞（高成瘤MDCK-W73、弱成瘤MDCK-C35、較弱成瘤MDCK-C09）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析可知，F(xiàn)LT4、GALNT12、SQSTM1、FOXN2、TNFAIP8、ELP1、STOM、RBMS2、RBMS2、SHB、GCAT、AFF4和GOPC可能是導(dǎo)致MDCK成瘤性的關(guān)鍵基因，對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 總RNA抽提

收取MDCK-W73、MDCK-CL35以及MDCKCL09細(xì)胞（6孔板80%細(xì)胞密度），放在新的無(wú)RNase 的1.5 ml離心管中，加入500μl Trizol，置于冰上5 min，使細(xì)胞充分裂解。4℃ 12 000 g，離心5 min，去除沉淀；每管加入200μl氯仿，振蕩混勻，冰上靜置15min。4℃12 000 g，離心15min，小心吸取200 μl上清，加入到新的預(yù)冷的無(wú)RNase的1.5 ml離心管中。在新的1.5ml離心管中加入等體積預(yù)冷的異丙醇，振蕩混勻后冰上放置10 min；4℃ 12 000 g，離心10 min，棄上清，保留沉淀。加入500 μl 75 %乙醇（用DEPC水新鮮配制），將沉淀輕輕重懸；4℃ 8 000g，離心5 min，去除大部分上清液，保留沉淀；室溫放置5 min，使殘留液體揮發(fā)。待RNA沉淀基本透明時(shí)，加入無(wú)DNase/RNase ddH2O（加入體積視RNA沉淀量而定）至完全溶解，-80℃保存?zhèn)溆肹6]。使用NanoDrop2000分析測(cè)定所抽提RNA濃度純度，使用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定抽提RNA的完整性。

1.2 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA

根據(jù)promega reverse transcription system 操作說(shuō)明，反應(yīng)溫度及程序設(shè)置：70℃反應(yīng)5 min，冰上放置5 min。

如表1混合上述物質(zhì)，按表2反應(yīng)體系（冰上進(jìn)行），混勻，短暫離心；反應(yīng)溫度及程序設(shè)置：25℃反應(yīng)5 min，42℃水浴反應(yīng)1 h，70℃水浴15 min（使RT酶失活），將得到的RT產(chǎn)物 -cDNA置于-20℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)成瘤相關(guān)基因表達(dá)

收取細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。按照All-in-one SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明書(shū)對(duì)表3中的反應(yīng)體系進(jìn)行配置，利用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行不同基因（引物序列見(jiàn)表4）相對(duì)表達(dá)量的分析。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，94℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，共四十個(gè)循環(huán)。

表1 試劑及反應(yīng)體系

表2 試劑及反應(yīng)體系

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用相對(duì)定量分析F=2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；

-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；

2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)NC組樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表3 反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取與質(zhì)檢結(jié)果

使用NanoDrop2000分析測(cè)定所抽提RNA濃度純度，使用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定抽提RNA的完整性。如表5所示，所有樣本的OD260/280均分布于2.01～2.08之間，OD260/230均分布于2.05-2.13之間。OD260/280比值分布于1.8～2.1之間，OD260/230≥1.5提示提取的RNA純度高。

對(duì)各組樣本的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結(jié)果顯示有18 s和28 s兩條條帶，RNA條帶清晰，無(wú)色素、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染。結(jié)果表示試驗(yàn)中提取的RNA純度高，沒(méi)有發(fā)生降解；無(wú)蛋白質(zhì)、DNA等其他殘留，樣品質(zhì)量合格可以運(yùn)用到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

表4 引物序列信息

表5 RNA純度檢測(cè)結(jié)果

圖1 瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定抽提RNA的完整性

2.2 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

在 MDCK-W73、MDCK=C09和MDCK-C35中，各基因的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，GALNT12、SQSTM1、ELP1、TNFAIP8和STOM 在各組細(xì)胞中均極顯著表達(dá)（P≤0.01）。FLT4、FOXN2、GCAT、AFF4、SHB、GOPC 和RBMS2在各組細(xì)胞中均顯著表達(dá)（P≤0.05）。

圖2 MDCK細(xì)胞成瘤性相關(guān)基因的RT-PCR結(jié)果

2.3 qRT-PCR與高通量測(cè)序（RNA-Seq）的數(shù)據(jù)對(duì)比

將qRT-PCR的結(jié)果與細(xì)胞高通量測(cè)序（RNA-Seq）的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表6所示。除了RBMS2在MDCK-C09細(xì)胞中未檢測(cè)到基因表達(dá)，GCAT、GOPC在MDCK-C35細(xì)胞亦未檢測(cè)到基因表達(dá)，其余基因在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，RT-qPCR與RNA-Seq結(jié)果相一致。將各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量和FPKM制作成折線圖可以發(fā)現(xiàn)（圖3），各基因在不同成瘤性細(xì)胞中的表達(dá)具有差異性，且qRT-PCR與RNA-Seq的差異性表達(dá)相一致。由此說(shuō)明，RNA-Seq測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠，為后續(xù)的試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖3 各基因qRT-PCR的相對(duì)表達(dá)量和RNA-seq測(cè)序（FPKM）數(shù)據(jù)對(duì)比

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志[7-8]。目前，高通量測(cè)序開(kāi)始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。在本研究的前期試驗(yàn)中，選擇低成瘤細(xì)胞系MDCK-C09、MDCK-C35與高成瘤細(xì)胞系MDCK-W73進(jìn)行高通量測(cè)序（RNA-Seq），以期篩選出與MDCK細(xì)胞成瘤性相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行后續(xù)研究。在高通量測(cè)序中，mRNA的表達(dá)量結(jié)果以FPKM為單位，F(xiàn)PKM 能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)量的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣本間的基因表達(dá)差異。為了驗(yàn)證FLT4、GALNT12、SQSTM1、FOXN2、TNFAIP8、ELP1、STOM、RBMS2、RBMS2、SHB、GCAT、AFF4和 GOPC這12個(gè)關(guān)鍵基因是否如RNA-Seq測(cè)序中存在顯著性差異，對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行了qRT-PCR測(cè)定。

實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime RT-PCR，qRT-PCR）就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄PCR：先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進(jìn)行定量分析（qPCR）的以微量DNA進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的方法[9-10]。通過(guò)DNA鏈的熱變性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三個(gè)步驟循環(huán)往復(fù)，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增DNA達(dá)100萬(wàn)倍以上。本研究使用染料法進(jìn)行qPCR檢測(cè)。SYBR Green是一種非對(duì)稱花菁染料，能夠結(jié)合于所有雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域[11]。在游離狀態(tài)下，SYBR Green只發(fā)出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，當(dāng)將SYBR染料添加到PCR反應(yīng)體系中，SYBR能結(jié)合到模板和擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)出熒光，隨著每輪擴(kuò)增，產(chǎn)物量呈指數(shù)型上升，熒光也隨之上升并被儀器檢測(cè)到[12]。在qPCR的反應(yīng)程序設(shè)定中，通常情況下，即使模板是環(huán)狀質(zhì)?；蚧蚪MDNA，預(yù)變性時(shí)使用95℃ 30 s即可，也可以依據(jù)模板情況適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間到1～2 min。因變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)降低酶活性，所以不能超過(guò)2 min。如果Real Time PCR目的片段長(zhǎng)度低于300 bp，則95℃變性3～5 s即可。對(duì)于退火溫度，應(yīng)先嘗試常規(guī)程序。如需優(yōu)化溫度，在56～64℃范圍內(nèi)調(diào)整。如果反應(yīng)效果不好，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

表6 MDCK細(xì)胞成瘤性相關(guān)基因的RT-PCR的相對(duì)表達(dá)量和測(cè)序數(shù)據(jù)（FPKM）

qRT-PCR 定量分析結(jié)果的可靠性與內(nèi)參指標(biāo)密切相關(guān)，為了篩選出在所有樣本均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參指標(biāo)，本研究運(yùn)用能綜合分析的Ref Finder工具進(jìn)行篩選，結(jié)果表明β-actin在所有樣本中綜合穩(wěn)定度最高，其表達(dá)水平也與各因素?zé)o關(guān)，是理想的內(nèi)參指標(biāo)[13]。在整個(gè)PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸。