林曉敏 綜述 謝思明 審校

暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

刺猬信號通路Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎和組織發(fā)育中起重要作用[1-2]，其異常激活可能與人類多種惡性腫瘤相關(guān)，如卵巢癌[3]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[4]、肺癌[5]等。Hh信號通路通過Hh配體與十二次跨膜受體Patched1(Ptch1)的相互作用而啟動，減輕了Ptch1對G蛋白偶聯(lián)受體smoothened(Smo)的抑制作用。這種相互作用觸發(fā)了膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(Gli)的激活，激發(fā)Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。而絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused抑制因子(Sufu)通過與Gli相互作用并抑制Gli來抑制Hh信號通路。本文就Sufu在腫瘤中的研究進(jìn)展，主要是針對Sufu調(diào)控Gli的機(jī)制，以及Sufu蛋白自身的調(diào)控研究進(jìn)行綜述，為基于Sufu為靶點的治療方法提供了相關(guān)參考信息。

1 腫瘤中的Hh信號通路

目前研究認(rèn)為，不同腫瘤類型中異常Hh信號激活可能存在三種機(jī)制[7]。一種是不依賴配體的信號傳導(dǎo)，即通路成分突變導(dǎo)致的Hh信號通路異常激活。常見的有Ptch1基因突變引起的痣樣基底細(xì)胞癌綜合征(nevoid basal cell carcinoma syndrome，NBCCS)[8]，罕見的，肌肉腫瘤橫紋肌肉瘤中也發(fā)現(xiàn)了Ptch1和Sufu突變[9]。另外兩種為依賴配體的自/近分泌信號和依賴配體的旁分泌信號。哺乳動物分泌三種Hh配體(SHh、IHh、DHh)，SHh配體蛋白通過自分泌(與分泌它的腫瘤細(xì)胞結(jié)合)或旁分泌(由腫瘤細(xì)胞分泌，與附近的基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合或由基質(zhì)細(xì)胞分泌并被腫瘤細(xì)胞吸收)的方式，誘導(dǎo)細(xì)胞合成和分泌信號因子以激活Hh信號通路。其傳導(dǎo)過程如下：功能性SHh配體表達(dá)時，SHh與Ptch1結(jié)合，解除Ptch1對Smo的抑制，激活的Smo轉(zhuǎn)移至原纖毛(primary cilium，PC)中，通過某種機(jī)制(可能涉及將Gli與Sufu的抑制性復(fù)合物解離)在細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)導(dǎo)Hh信號以激活Gli[6]，最后，激活的Gli進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄激活一組特定基因，促進(jìn)腫瘤生長和侵襲。而這便是SHh經(jīng)典信號通路途徑，后面將簡單稱之為Hh通路。Ptch1抑制Smo的機(jī)制以及Sufu調(diào)節(jié)Hh信號通路的機(jī)制仍不清楚。

2 Hh信號通路中的Sufu

2.1 Sufu在調(diào)控Hh信號通路中起關(guān)鍵作用 Sufu基因首先在果蠅中被鑒定，然而哺乳動物中Sufu表現(xiàn)出更為重要的負(fù)調(diào)控作用。轉(zhuǎn)基因小鼠實驗中，敲除Sufu等位基因可導(dǎo)致胚胎死亡，并伴隨嚴(yán)重的背部開放性神經(jīng)管缺損；Sufu+/-雜合子小鼠也出現(xiàn)Hh信號傳導(dǎo)增強(qiáng)，且與敲除Ptch1表現(xiàn)的表型一樣嚴(yán)重[10]；Sufu+/-p53-/-小鼠個體也可發(fā)現(xiàn)與Ptc1+/-小鼠相似的髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma，MB)和橫紋肌肉瘤[11]，但單獨p53基因的缺失小鼠并不會產(chǎn)生上述結(jié)果。這些實驗提示Sufu缺失對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用。此外，Sufu突變可引起經(jīng)典的NBCCS，且其患MB的風(fēng)險是Ptch1突變個體的20倍高[12]。NBCCS某些表型特征，如手掌硬化性纖維瘤特征[13]、漏斗型囊性基底細(xì)胞癌[14]等在具有Sufu突變的個體或家庭中更為普遍。生殖系Sufu突變導(dǎo)致的MB常發(fā)生在3歲以下的患者中，其預(yù)后通常比普通SHh MB者差[15]。王美等[16]研究發(fā)現(xiàn)Sufu的突變可以促進(jìn)MB，其細(xì)胞實驗也證實了Sufu通過結(jié)合Gli蛋白從而抑制其功能。皮膚錯構(gòu)瘤[17]中也發(fā)現(xiàn)了Sufu相關(guān)基因的突變。綜上所述，無論Hh配體存在與否，Sufu蛋白的失活都足以激活Hh信號通路，與多種人類腫瘤密切相關(guān)。這與Sufu在Hh信號通路中起關(guān)鍵抑制作用是相符合的。然而，有研究發(fā)現(xiàn)Hh誘導(dǎo)的Gli轉(zhuǎn)錄激活可能獨立于Sufu而發(fā)生，Sufu的活性降低可以減少Hh對高閾值神經(jīng)管凋亡的誘導(dǎo)[18]。這提示Sufu可能在Hh信號通路中還存在正向調(diào)節(jié)作用。YIN等[19]最近證明了Sufu通過維持強(qiáng)大的Gli活性，在Smo激活的MB中起促腫瘤作用，確立了Sufu在SHh MB中的雙重作用。這些研究提示Sufu在腫瘤中的生物學(xué)功能可能存在兩面性。

2.2 Sufu調(diào)節(jié)Gli機(jī)制 大量研究揭示Sufu通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)Gli(鋅指蛋白Gli1、Gli2和Gli3)的轉(zhuǎn)錄活性，抑制Hh信號傳導(dǎo)。但Sufu調(diào)控Hh信號通路的機(jī)制仍存在爭議，這一直是這個領(lǐng)域的研究熱點。細(xì)胞質(zhì)中，Sufu通過結(jié)合Gli阻止Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，最終調(diào)節(jié)Hh通路活性。研究發(fā)現(xiàn)，Sufu與核轉(zhuǎn)運受體蛋白importinβ1競爭結(jié)合Gli1的相同位點，阻礙importinβ1介導(dǎo)的Gli1的核易位[20]。Sufu和importinβ1的相對細(xì)胞內(nèi)濃度可能決定Gli1的定位，從而影響其在腫瘤以及發(fā)育系統(tǒng)中的作用。Sufu還通過掩蓋Gli的核定位序列，阻礙由核蛋白β2(karyopherinβ2)介導(dǎo)的Gli2/3的核積累[21]。Sufu在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控Gli過程如圖1[22]。沒有功能性Hh配體時，PC相關(guān)驅(qū)動蛋白(Kif7)、Sufu和全長Gli2/3組成胞質(zhì)蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物被蛋白激酶A(PKA)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1(CK1)磷酸化，隨后高磷酸化的全長Gli2/3蛋白經(jīng)SCF(Slimb/β-TrCP)泛素連接酶介導(dǎo)而部分降解，截短了C端轉(zhuǎn)錄激活域，水解為Gli阻遏物(GliR)。GliR移動至細(xì)胞核內(nèi)與全長的GLI2/3競爭相同的調(diào)節(jié)序列，抑制了Hh靶基因表達(dá)。當(dāng)Hh配體表達(dá)時，激活的Smo使得Sufu-Gli復(fù)合物募集到PC末端，隨后復(fù)合物快速解離，釋放出全長Gli2/3。Gli2/3作為Gli激活劑(GliA)取代GliR進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子結(jié)合，并激活Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄。最近有實驗顯示，Sufu是一個胞質(zhì)穿梭蛋白，Sufu伴隨著GliA和GliR進(jìn)入細(xì)胞核[23]，可能促進(jìn)GliA迅速從細(xì)胞核中輸出。細(xì)胞核內(nèi)，Sufu可與DNA分子中的Gli結(jié)合序列結(jié)合并阻止基因轉(zhuǎn)錄，還能通過招募SAP18-mSin3-HDAC轉(zhuǎn)錄共抑制復(fù)合物來抑制Gli的轉(zhuǎn)錄活性[24]。此外，CHUWEN等[25]發(fā)現(xiàn)Sufu還可以募集p66β(核小體重構(gòu)和組蛋白脫乙?；窷uRD的阻遏物復(fù)合物的成員)來阻斷Gli介導(dǎo)的Hh靶基因表達(dá)。而Hh途徑激活導(dǎo)致Sufu/p66β與Gli分離，促進(jìn)Gli蛋白活性。Sufu對Gli的綜合調(diào)控主要靠調(diào)控GliR和GliA的濃度比值，以維持梯度Hh通路活性[26]，這對于實現(xiàn)多細(xì)胞生物中Hh通路的復(fù)雜生理功能至關(guān)重要。還有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)Sufu的定位與Gli蛋白有關(guān)，Sufu在核內(nèi)的穩(wěn)定性受Gli蛋白家族成員調(diào)控[27]。這表明，Sufu本身活性也受到Hh信號調(diào)控，進(jìn)而控制靶基因的表達(dá)。Sufu是Hh通路中最保守的成分之一,Sufu與Gli蛋白的物理解離是Hh通路激活的主要特征。因而，對Sufu蛋白結(jié)構(gòu)的探索，有助于解釋Sufu和Gli之間的物理相互作用。Sufu蛋白晶體單體由兩個球狀域組成，即NTD(氨基末端域)和CTD(羧基末端域)，兩者之間有一個短的連接子。有文獻(xiàn)報道，細(xì)胞質(zhì)中Sufu可以通過其NTD來束縛的Gli蛋白，而細(xì)胞核中，則通過其CTD抑制Gli[28]。Sufu蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域采取β片疊加的方式將Gli夾在中間，呈現(xiàn)出封閉構(gòu)象[29]。Hh激活誘導(dǎo)Sufu由封閉轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放構(gòu)象，導(dǎo)致Sufu與Gli蛋白SYGHL序列之間的相互作用降低，具體的機(jī)制尚不清楚。王美等[16]發(fā)現(xiàn)突變位點R146X、R299X、R430X3處的Sufu突變體破壞了和Gli的結(jié)合，這為深入了解Sufu結(jié)構(gòu)的改變影響其功能提供了條件。可見，Sufu與Gli結(jié)合界面在Sufu調(diào)控Gli中起著至關(guān)重要的作用，介導(dǎo)結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸殘基突變可以破壞Sufu-Gli蛋白之間的相互作用從而調(diào)控Hh信號通路，值得未來深入研究。綜上所述，Sufu參與調(diào)節(jié)Gli蛋白以及Hh信號從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)Gli的亞細(xì)胞定位和穩(wěn)定性，實現(xiàn)Gli蛋白在Hh信號梯度下的分級活性。這些復(fù)雜的調(diào)控依靠Sufu與Gli之間的物理相互作用以及其他因素共同作用。

3 Sufu蛋白活性的調(diào)節(jié)

相較于Sufu在調(diào)控Gli方面的較廣泛的研究，Sufu蛋白自身活性的調(diào)控仍較模糊。近來研究發(fā)現(xiàn)，翻譯后修飾將影響Sufu蛋白的穩(wěn)定，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

Hh通路激活能誘導(dǎo)Sufu多聚泛素化，使Sufu隨后被蛋白酶降解失去穩(wěn)定性，這可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。最近的一項研究表明，MB中E3泛素連接酶SCF(Skp1-Cul1-F-box)蛋白Fbxl17(F-box和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白17)在細(xì)胞核中能夠靶向的Sufu蛋白水解，使Gli1從Sufu-Gli1復(fù)合物中釋放出來以進(jìn)行適當(dāng)?shù)腍h信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)MB的形成[30]。這表明，泛素-蛋白酶途徑介導(dǎo)的降解對Sufu在翻譯后水平的調(diào)控具有重要意義。同樣的，磷酸化也在調(diào)節(jié)Sufu穩(wěn)定性中起重要作用。與泛素化作用相反，糖原合成酶激酶-3(GSK3 β)、環(huán) 磷 酸 腺 苷 (cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、PKA等引起的Sufu磷酸化，可促進(jìn)其穩(wěn)定化。當(dāng)Hh通路激活時，Sufu被轉(zhuǎn)運出PC并通過蛋白酶途徑降解。PKA和GSK3β在Ser-346和Ser-342處的雙重磷酸化可以延長Sufu在PC中的停留時間并穩(wěn)定蛋白質(zhì)[31]。廖恒青等[32]研究發(fā)現(xiàn)Sufu發(fā)生磷酸化修飾后對MB的抑制作用增強(qiáng)而非磷酸化的Sufu突變體抑癌作用明顯減弱，該研究還認(rèn)為磷酸化Sufu主要聚集在細(xì)胞核。WANG等[33]通過酵母雙雜交實驗篩選鑒定了絲氨酸/蘇氨酸激酶Nek2A是一種與Sufu相互作用的蛋白酶。該酶可以在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化并穩(wěn)定Sufu，從而抑制Hh/Gli2信號通路。上述實驗證實了泛素化使Sufu失穩(wěn)而磷酸化穩(wěn)定Sufu的作用。然而，INFANTE等[34]最近提出了泛素化對Sufu調(diào)節(jié)的新機(jī)制，他們在MB中發(fā)現(xiàn)具有HECT(與E6相關(guān)的蛋白質(zhì)羧基末端）結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶Itch，它與銜接蛋白β-arrestin2的復(fù)合物可以結(jié)合Sufu，促進(jìn)Sufu的K63連接泛素化。但該過程并不會影響Sufu的穩(wěn)定性，反而促進(jìn)Sufu-Gli3復(fù)合物的形成，增加Gli3R的量，阻斷Hh通路。這證明Itch介導(dǎo)的Sufu泛素化能抵抗MB腫瘤形成。該研究還發(fā)現(xiàn)Sufu的突變體則對Itch介導(dǎo)的泛素化不敏感，能刺激MB發(fā)病。

上述研究結(jié)果表明，磷酸化和泛素化等翻譯后修飾的過程，很可能復(fù)雜精密地調(diào)節(jié)Sufu蛋白的穩(wěn)定性，影響其腫瘤調(diào)控作用。目前還需要更多的研究來揭示其他的調(diào)控和它們之間的關(guān)系。

除了翻譯后修飾，許多外泌體也能影響Sufu蛋白表達(dá)活性從而調(diào)節(jié)腫瘤的生長。早前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-378可以通過減弱Sufu和TUSC2(腫瘤抑制因子候選基因2)的翻譯來促進(jìn)細(xì)胞存活、腫瘤生長和血管生成[35]。miR-214可以直接靶向Sufu mRNA并破壞其功能，從而促進(jìn)肺腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移[36]。近期在乳腺癌中還發(fā)現(xiàn)其他調(diào)節(jié)因子，如lncRNA GAS5(長鏈非編碼RNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5)通過靶向miR-378a-5p/Sufu信號傳導(dǎo)促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡[37]。LIFR-AS1(白血病抑制因子受體反義RNA1)與miR-197-3p競爭結(jié)合而上調(diào)Sufu，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[38]。miR-423-5p[39]、miR-224[40]、14-3-3ζ(調(diào)節(jié)蛋白)[23]近期也被發(fā)現(xiàn)與Sufu共同作用調(diào)控胃癌、膀胱癌、宮頸癌的癌細(xì)胞增殖和遷移以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。然而各類外泌體對Sufu具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確，以Sufu自身為核心的調(diào)控體系仍需不斷探索。

4 展望

Hh信號傳導(dǎo)異常涉及多種人類惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，盡管已有許多相關(guān)研究，通路級聯(lián)內(nèi)的機(jī)制仍然難以捉摸。目前Hh信號通路在腫瘤治療方面的研究主要是Smo抑制劑[41-42]的開發(fā)，這對通路下游基因突變以及Hh信號非經(jīng)典傳導(dǎo)途徑形成的腫瘤有較大的局限性。本文綜述了Sufu對腫瘤中Hh信號通路的影響以及Sufu調(diào)控Hh信號通路的機(jī)制，還討論了Sufu蛋白自身活性的調(diào)控。確定了Sufu-Gli復(fù)合體在Hh通路中重要的地位，并從多方面解析了Sufu對腫瘤的調(diào)控作用。為基于Sufu為靶點的治療方法提供了相關(guān)參考信息。