吳英珂，王衛(wèi)星

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430060）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種由多種病因引起的胰酶異常激活后導(dǎo)致胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥性疾病，多數(shù)患者病情表現(xiàn)較輕，但仍有20%～30%患者可進(jìn)一步發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP ），SAP患者通常伴有一個(gè)或多個(gè)器官功能障礙[1]。AP炎癥過(guò)程中細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，臨床上尚缺乏有效的治療方法。線粒體是細(xì)胞ATP合成的重要場(chǎng)所，近年來(lái)研究[2]表明線粒體損傷是AP發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。目前研究多認(rèn)為鈣超載作為起始病理過(guò)程導(dǎo)致腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙。隨后線粒體損傷與ATP耗竭、線粒體通透性改變、自噬損傷等多種病理機(jī)制介導(dǎo)腺泡細(xì)胞損傷和壞死，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[3-5]。此外AP的病情與壞死程度直接相關(guān)，而線粒體在調(diào)控細(xì)胞凋亡壞死平衡中具有重要作用。因此對(duì)線粒體損傷在AP發(fā)展過(guò)程中的基本病理機(jī)制進(jìn)行深入探討可為臨床上AP的治療開辟新的途徑。

1 正常腺泡細(xì)胞線粒體功能與分布

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)膜和外膜兩部分組成的細(xì)胞器，由外到內(nèi)分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜以及基質(zhì)4 個(gè)功能區(qū)。線粒體內(nèi)膜向內(nèi)凹陷形成嵴，包含呼吸鏈蛋白和各種酶系，在膜間隙和基質(zhì)之間形成相對(duì)不滲透的屏障；外膜具有孔蛋白構(gòu)成的親水通道，對(duì)離子和小分子的通透性較高[6]。線粒體的主要功能是為細(xì)胞提供各種功能活動(dòng)所需要的能量。此外，線粒體還是細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的主要來(lái)源，并且在細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡中均有重要調(diào)控作用[7]。

胰腺腺泡細(xì)胞中有3組不同的線粒體，分別是位于顆粒區(qū)和基底外側(cè)區(qū)之間邊界上的粒周線粒體，靠近質(zhì)膜處基底外側(cè)區(qū)的外周（或質(zhì)膜下）線粒體，和圍繞著細(xì)胞核的核周線粒體[8]。3組不同的線粒體在細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著不同的作用。粒周線粒體防止Ca2+信號(hào)擴(kuò)散到細(xì)胞的基底區(qū)，將生理Ca2+信號(hào)限制在頂端區(qū)域[9]。外周線粒體在局部為Ca2+泵介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+提供所需的ATP，并且有充分的證據(jù)表明線粒體功能在鈣庫(kù)操控性的鈣內(nèi)流中起著至關(guān)重要的作用[9-10]。而核周線粒體作為細(xì)胞核的保護(hù)屏障，使細(xì)胞核免受Ca2+信號(hào)的入侵[8]。

2 線粒體鈣超載

最近研究[11]表明線粒體損傷和ATP耗竭在AP的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度病理性升高是AP發(fā)病早期的標(biāo)志性事件[12]。膽汁酸和非氧化乙醇代謝物可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放，并激活腺泡細(xì)胞膜上的鈣釋放激活鈣通道蛋白1（ORAI1）誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流[13]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)升高導(dǎo)致線粒體Ca2+超載和細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少[14]。在這種情況下粒周線粒體不能緩沖頂端Ca2+濃度的升高，導(dǎo)致局部的Ca2+信號(hào)擴(kuò)散到整個(gè)腺泡細(xì)胞[15]。由于ATP是肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarco-endoplasmic reticulum Ca2+pump，SERCA）和質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）清除胞漿中Ca2+所必需的[16]，ATP生成的降低會(huì)損害細(xì)胞內(nèi)Ca2+清除能力，從而進(jìn)一步促進(jìn)了胞內(nèi)Ca2+的持續(xù)升高。持續(xù)的Ca2+超載導(dǎo)致線粒體膜通透性改變和線粒體損傷，這種惡性循環(huán)最終導(dǎo)致腺泡細(xì)胞壞死。因此，抑制或消除鈣超載的毒性作用是AP的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，而Orai1通道的小分子抑制劑是目前治療AP最有前途的藥物之一[17]。Waldron等[18]應(yīng)用ORAI1通道抑制劑CM4620減輕了AP小鼠和人腺泡細(xì)胞的壞死。目前該藥已完成第一階段臨床試驗(yàn)，將進(jìn)入第二階段臨床試驗(yàn)以評(píng)估其在AP患者中的安全性和有效性[12]。

3 細(xì)胞內(nèi)ATP 耗竭

Maléth等[19]在離體豚鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中觀察到高濃度的非結(jié)合膽汁酸引起線粒體的形態(tài)學(xué)損傷和隨后的ATP耗竭。此外，他們還發(fā)現(xiàn)ATP耗竭可直接抑制胰管碳酸氫鹽和液體的分泌。在膜片鉗全細(xì)胞記錄中通過(guò)增加貼片移液管中ATP的濃度可以在體外補(bǔ)充細(xì)胞ATP。Judák等[20]通過(guò)貼片移液管在細(xì)胞內(nèi)給予5 mM ATP降低了乙醇、棕櫚油酸、棕櫚油酸乙酯對(duì)分離豚鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中囊性纖維跨膜調(diào)控因子（cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR）氯離子通道的抑制作用。Booth等[21]用同樣的方法補(bǔ)充ATP阻止了?；悄懰崃蛩猁}（TLC-S）導(dǎo)致的腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+的持續(xù)升高和壞死。這些研究提示體外補(bǔ)充ATP可以防止AP時(shí)腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞的功能障礙和損傷，然而這種方法仍只能停留在實(shí)驗(yàn)研究階段。一項(xiàng)多中心雙盲隨機(jī)對(duì)照臨床研究[22]表明，通過(guò)早期高熱量腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持ATP生成對(duì)AP患者來(lái)說(shuō)是必要的。此外，近年來(lái)臨床對(duì)腸道喚醒作用的重視使得腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成為AP治療過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán)[23]。

4 線粒體膜通透性改變

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochon drial permeability transition pore，MPTP）是位于線粒體內(nèi)膜上的對(duì)環(huán)孢菌素A敏感的高電導(dǎo)通道，由Ca2+激活。一旦被激活，它允許小于1500 Da溶質(zhì)和水在線粒體內(nèi)膜上非選擇性擴(kuò)散[24]。MPTP形成的具體分子機(jī)制還未完全明確，最近有研究[25-26]表明F0F1ATP合成酶參與MPTP的形成。MPTP有一過(guò)性開放和持續(xù)性開放兩種開放狀態(tài)。前者被認(rèn)為是生理性的，通過(guò)在線粒體基質(zhì)和信號(hào)傳導(dǎo)所需的細(xì)胞質(zhì)之間快速交換溶質(zhì)（例如Ca2+，氧自由基）來(lái)發(fā)揮生理作用。而持續(xù)性的開放則是病理性的，導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，活性氧釋放，細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)受損，線粒體腫脹，以及促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中以引發(fā)細(xì)胞死亡[24]。這兩種功能均受親環(huán)素D的調(diào)控[27]。

胰腺炎致病因素通過(guò)第二信使受體三磷酸肌醇（inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor，IP3R）引起鈣的異常釋放，從而使對(duì)鈣信號(hào)敏感的胰腺腺泡線粒體超載，進(jìn)而引起高電導(dǎo)MPTP的持續(xù)開放和膜電位喪失，導(dǎo)致ATP生成崩潰和隨后的壞死[28]。而在小鼠或人胰腺腺泡細(xì)胞，藥理性或遺傳性地抑制MPTP對(duì)AP中的膜電位丟失、ATP生成障礙和壞死有保護(hù)作用[28]。這一機(jī)制在雨蛙素誘導(dǎo)、TLC-S誘導(dǎo)、脂肪酸乙酯誘導(dǎo)和氨基酸誘導(dǎo)胰腺炎等多種AP模型中得到證實(shí)，在親環(huán)素D基因敲除小鼠和給予PMTP抑制劑TRO40303的野生型小鼠中典型的病理反應(yīng)明顯減輕[28-29]。此外，另一研究[30]顯示親環(huán)素D小分子抑制劑也能通過(guò)保護(hù)線粒體減輕小鼠和人腺泡細(xì)胞的壞死，改善AP的嚴(yán)重程度。綜上所述MPTP是AP治療的一個(gè)潛在藥物靶點(diǎn)，然而無(wú)論是TRO40303還是親環(huán)素D抑制劑都需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)以驗(yàn)證其臨床有效性。

5 腺泡細(xì)胞自噬受損

生理?xiàng)l件下，大自噬通過(guò)自噬體形成，及隨后的自噬體與溶酶體融合來(lái)降解衰老、受損的細(xì)胞器，從而對(duì)腺泡細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[31]。而當(dāng)溶酶體相關(guān)膜蛋白（LAMPs）降解導(dǎo)致自噬受損時(shí)，大量異常增大的含有未消化降解物質(zhì)的自噬體堆積，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞酶原顆粒的降解效率降低和酶原激活[32-33]。自噬效率降低主要表現(xiàn)為胰腺的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II和自噬底物p62/SQSTM1水平的增加，泛素化蛋白積累增多[34]。AP中溶酶體蛋白水解功能下降的一個(gè)特點(diǎn)是組織蛋白酶的加工成熟缺陷，尤其是關(guān)鍵的組織蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）。有研究[35]發(fā)現(xiàn)在L-精氨酸（L-Arg）誘導(dǎo)AP 模型中，親環(huán)素D 基因敲除不僅恢復(fù)了CTSB的加工成熟，而且使自噬通量正常，導(dǎo)致LC3-II、p62和泛素化蛋白水平下降和腺泡細(xì)胞空泡化的明顯減少。為了進(jìn)一步證實(shí)AP中線粒體與自噬損傷的關(guān)系，研究者使用GFP-LC3小鼠與親環(huán)素D基因敲除小鼠雜交的小鼠，親環(huán)素D在GFPLC3小鼠體內(nèi)的消融幾乎完全阻止了Arg-AP誘導(dǎo)的內(nèi)源性LC3-II和GFP-LC3-II的積累[28,35]。另有研 究[36]表明，Arg-AP激活的線粒體自噬同樣被親環(huán)素D基因敲除所阻止。親環(huán)素D敲除使自噬正?；崾咀允墒軗p可能是線粒體損傷的關(guān)鍵下游效應(yīng)。

近年來(lái)的研究顯示調(diào)控自噬的藥物可能對(duì)AP的治療具有意義。應(yīng)用海藻糖使Arg-AP模型中的自噬活性增強(qiáng)后，小鼠的胰腺炎反應(yīng)明顯減輕，且胰蛋白酶原的活化被完全阻止[35]。此外，BRD4和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）均能通過(guò)上調(diào)SIRT1來(lái)恢復(fù)自噬通量，從而減輕小鼠AP嚴(yán)重程度[37-38]。番茄紅素可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬來(lái)減輕小鼠的AP嚴(yán)重程度，然而需要更多的研究來(lái)確定其具體機(jī)制以及其對(duì)人類胰腺炎的預(yù)防和治療作用[39]。臨床回顧性研究顯示他汀類藥物可降低AP的發(fā)病率及改善預(yù)后[40-41]。而在大鼠AP模型中，辛伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬體與溶酶體融合恢復(fù)了自噬通量，從而減輕了線粒體損傷和AP炎癥反應(yīng)[42]。辛伐他汀在臨床應(yīng)用中具有安全性，然而其在AP患者中的有效性還有待臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。線粒體損傷和自噬受損都是AP發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進(jìn)一步研究?jī)烧唛g具體分子機(jī)制與聯(lián)系并使這些途徑正?；兄谡业紸P的潛在治療方法。

6 AP 中細(xì)胞死亡的線粒體機(jī)制

線粒體除了提供能量，還在細(xì)胞死亡的調(diào)控中起著核心作用，包括細(xì)胞凋亡和壞死[6]。線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的核心作用主要通過(guò)線粒體膜通透性（mitochondrial membrane permeabilization，MMP）來(lái)實(shí)現(xiàn)。線粒體膜通透性觸發(fā)凋亡和壞死途徑的主要形式分別是線粒體駐留蛋白細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)和線粒體去極化。線粒體去極化由MPTP介導(dǎo)，導(dǎo)致膜電位喪失并最終引起ATP耗竭和壞死。而線粒體外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeability，MOMP）系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C可與凋亡蛋白酶激活因子1和凋亡蛋白procaspase-9相互作用，形成凋亡小體并激活procaspase-9。caspase-9依次激活效應(yīng)物caspase例如caspase-3，進(jìn)而介導(dǎo)下游的凋亡事件[43]。因此，線粒體中的MMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞兩種死亡途徑的中心環(huán)節(jié)。

腺泡細(xì)胞死亡是AP 的主要病理反應(yīng)之一，在AP過(guò)程中，腺泡細(xì)胞同時(shí)發(fā)生壞死和凋亡。值得注意的是，動(dòng)物模型中AP的嚴(yán)重程度與壞死程度成正比，與凋亡程度成反比[44]。此外，刺激腺泡細(xì)胞凋亡可減少壞死和AP的嚴(yán)重程度，而應(yīng)用caspase抑制劑抑制凋亡則壞死加重[44]。經(jīng)典的MPTP開放的一個(gè)關(guān)鍵特征是線粒體腫脹，導(dǎo)致線粒體外膜破裂。而胰腺M(fèi)PTP具有與典型MPTP不同的性質(zhì)特點(diǎn)，Ca2+誘導(dǎo)的離體胰腺線粒體去極化與腫脹和線粒體外膜破裂無(wú)關(guān)[45]。此外，Ca2+誘導(dǎo)的去極化使胰腺線粒體中的ROS顯著降低[45]，而肝和其他器官線粒體中的MPTP開放則導(dǎo)致ROS大量釋放。研究[46]表明ROS氧化心磷脂可促進(jìn)細(xì)胞色素C脫離，增加細(xì)胞膜間隙細(xì)胞色素C水平從而引起釋放。因此，由于胰腺M(fèi)PTP的特殊性，其內(nèi)存在一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即線粒體去極化抑制細(xì)胞色素C的釋放。這種負(fù)調(diào)控機(jī)制的影響是膜電位的丟失不僅介導(dǎo)壞死，同時(shí)也會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，胰腺炎腺泡細(xì)胞的死亡方式是在線粒體水平上通過(guò)Ca2+、膜電位水平和ROS的相互作用來(lái)調(diào)控的[47]。

此外，Bcl-2家族蛋白也是細(xì)胞死亡的重要調(diào)控因子，尤其是對(duì)凋亡的調(diào)控，它們通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，介導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中來(lái)發(fā)揮作用[48]。對(duì)分離的線粒體和腺泡細(xì)胞的研究表明，上調(diào)蛋白Bcl-XL和Bcl-2的表達(dá)通過(guò)防止線粒體去極化和隨后的ATP耗竭防止胰腺腺泡細(xì)胞壞死[49]。此外，研究顯示高壓氧療法通過(guò)誘導(dǎo)AP大鼠caspase依賴的凋亡減輕AP嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能是通過(guò)Bcl-2家族成員調(diào)控線粒體凋亡途徑[50]。缺氧誘導(dǎo)因子1α基因敲低通過(guò)維持線粒體穩(wěn)態(tài)改善細(xì)胞內(nèi)能量應(yīng)激，減輕壞死促進(jìn)凋亡，從而降低AP炎癥反應(yīng)[51]。靶向線粒體對(duì)細(xì)胞凋亡與壞死的平衡進(jìn)行調(diào)控可能是AP的一個(gè)潛在治療策略。

7 總結(jié)與展望

AP的病理發(fā)展機(jī)制是由多種因素介導(dǎo)的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，而線粒體損傷在其中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。鈣超載、ATP耗竭、線粒體膜通透性改變、自噬受損等在AP病理發(fā)展過(guò)程中互相影響，而作為細(xì)胞能量供應(yīng)中心，線粒體的損傷始終貫穿在這些病理機(jī)制中，深入探討其與各個(gè)環(huán)節(jié)之間的具體機(jī)制，有助于找到新的臨床上治療AP的方法。此外，線粒體對(duì)細(xì)胞死亡途徑的調(diào)控也在AP中發(fā)揮著重要作用，然而線粒體是否可以作為靶點(diǎn)在臨床上治療AP仍需要更進(jìn)一步的探究。