許冀， 佘秋芳， 彭金娥， 湯瑜， 楊亞東**

(1.李時珍中醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 蘄春 435300； 2.黃岡市中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 黃岡 438000)

急性胰腺炎是一種較為棘手的消化系統(tǒng)疾病，是一種由于多種原因所導(dǎo)致的胰酶在胰腺內(nèi)被激活后，所引起的胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥的反應(yīng)，研究認(rèn)為胰腺腺泡細(xì)胞的過度凋亡與急性胰腺炎有關(guān)[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)能夠在多個層面上發(fā)揮基因調(diào)控作用，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3-6]。生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-specific 5，GAS5)是一種lncRNA，最早被發(fā)現(xiàn)于鼠NIH3T3細(xì)胞，人類GAS5定位于1號染色體長臂，包含12個外顯子和11個內(nèi)含子，GAS5可參與腫瘤、缺氧腦損傷等病理過程[7-8]。有研究顯示，在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡中GAS5低表達(dá)，而上調(diào)GAS5減少細(xì)胞凋亡，改善軟骨細(xì)胞損傷[9]，目前尚缺乏GAS5在急性胰腺炎腺泡細(xì)胞中的研究。生物信息學(xué)軟件starbase預(yù)測發(fā)現(xiàn)GAS5和微小RNA-135a(micro RNA-135a，miR-135a)存在結(jié)合位點(diǎn)。有研究表明miR-135a在急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促進(jìn)作用，沉默miR-135a可減少腺泡細(xì)胞凋亡[10]。本研究以雨蛙肽(caerulein)體外誘導(dǎo)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞模型，探討GAS5對急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制是否與miR-135a有關(guān)，為分子靶向治療急性胰腺炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 胰腺腺泡細(xì)胞AR42J購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，C-Caspase-3)抗體(美國Cell Signaling Technology)，陰性對照載體和GAS5過表達(dá)載體(湖南普拉特澤生物)，GAS5野生型螢光素酶報告載體(GAS5 wild-type luciferase reporter vector，WT)和GAS5突變型螢光素酶報告載體(GAS5 mutant luciferase reporter vector，MUT；廣州伯信)，miR-135a mimics和mimics control(山東維真)，C-Caspase-9抗體(美國Abcam)，螢光素酶活性測定試劑盒(上海翊圣)，caerulein(美國Santa)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Precision Scientific)，LightCycler480 熒光定量PCR儀(美國Roche)，Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國Thermo)，F(xiàn)ACS caliber流式細(xì)胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)(美國BD)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 胰腺腺泡細(xì)胞分為Control組、Caerulein組、Caerulein+Vector組、Caerulein+GAS5組、Caerulein+GAS5+miR-135a組及Caeru-lein+GAS5+miR-NC組，Caerulein組、Caerulein+Vector組及Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞分別用含有10 nm/L的caerulein培養(yǎng)液刺激24 h；Caerulein+Vector組、Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞分別在實(shí)驗(yàn)前轉(zhuǎn)染陰性對照載體、GAS5過表達(dá)載體；Caerulein+GAS5+miR-135a組和Caerulein+GAS5+miR-NC組胰腺腺泡細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GAS5過表達(dá)載體、miR-135a mimics和GAS5過表達(dá)載體、mimics control共轉(zhuǎn)染后用10 nmol /L caerulein刺激24 h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法完全按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行；Control組為正常培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)胞。胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素及100 kU/L青霉素的F12K。

1.2.2細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，加CCK-8溶液10 μL/孔，37 ℃孵育4 h；取出細(xì)胞培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀于490 nm波長檢測吸光度(optical density，OD)值；計算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率(%)=(OD對照組/OD實(shí)驗(yàn)組)×100%]。

1.2.3實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(realtime polymerase chain reaction，Realtime PCR)檢測GAS5表達(dá) 各組胰腺腺泡細(xì)胞中添加Trizol試劑，反復(fù)吹打，充分裂解，常規(guī)方法提取細(xì)胞RNA；1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水制備TE buffer空白對照，以紫外分光光度計測定RNA；在無RNA酶的PCR管中添加Oligo(dT)1 μL和RNA 3 μg，RNase-free水補(bǔ)足到12 μL，65 ℃孵育5 min，置于冰上，加5×reaction buffer 4 μL、RNA酶抑制劑1 μL、dNTP mix 2 μL及M-MLV 1 μL，混合，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，cDNA于-20 ℃條件下保存；PCR擴(kuò)增體系為cDNA 0.8 μL、上下游引物0.4 μL、2×Taq PCR master mix 12.5 μL，最后添加RNase-free ddH2O至25 μL；PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，GAS5表達(dá)量計算按照2-ΔΔCt法計算，β-actin為內(nèi)參。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 各組胰腺腺泡細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中，3 000 r/min離心10 min，吸棄上清；加結(jié)合緩沖液溶液400 μL和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)溶液5 μL，于室溫下結(jié)合15 min；加碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液5 μL，室溫孵育20 min；流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化。

1.2.5Western blot檢測C-Caspase-3和C-Caspase-9蛋白表達(dá) 各組胰腺腺泡細(xì)胞中添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，吸取溶液至離心管內(nèi)，4 ℃下9 450 r/min離心10 min，吸取上清，保存于-80 ℃；按照二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)方法對蛋白樣品進(jìn)行定量檢測；于蛋白樣品中加Loading Buffer混合，煮沸5 min；配制5%濃縮膠、12%分離膠，加蛋白樣品30 μg/孔，60 V電壓電泳，樣品進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至100 V，待溴酚藍(lán)染料進(jìn)入凝膠底部，關(guān)閉電源，取凝膠；據(jù)凝膠大小將硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)裁剪，甲醇中浸泡10 s；按常規(guī)三明治法轉(zhuǎn)膜2 h(轉(zhuǎn)膜電流為100 mA)，取NC膜，5%脫脂奶粉于室溫中封閉2 h，加C-Caspase-3、C-Caspase-9一抗(1 ∶1 000稀釋，室溫孵育2 h)、二抗(1 ∶4 000稀釋，室溫孵育2 h)中充分結(jié)合，電化學(xué)發(fā)光液(electro chemi luminescence，ECL)顯色；Quantity One分析條帶的灰度值，以β-actin為參照分析C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)。

1.2.6靶基因預(yù)測及鑒定 采用生物信息學(xué)軟件starbase進(jìn)行靶基因預(yù)測分析，GAS5和miR-135a存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，以螢光素酶報告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。分別在胰腺腺泡細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-135a mimics和WT(miR-135a+WT組)、mimics control和WT(miR-NC+WT組)、miR-135a mimics和MUT(miR-135a+MUT組)、mimics control和MUT(miR-NC+MUT組)，培養(yǎng)24 h，利用螢光素酶活性測定試劑盒分析細(xì)胞螢光素酶活性變化；收集Control組、Caerulein組、Caerulein+Vector組及Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞，采用Realtime PCR法檢測各組細(xì)胞中miR-135a表達(dá)，結(jié)果以U6為內(nèi)參，分析miR-135a表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GAS5表達(dá)

與Control組比較，Caerulein組胰腺腺泡細(xì)胞中GAS5表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Caerulein+Vector組比較，Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞中GAS5表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表1。

2.2 胰腺腺泡細(xì)胞增殖和凋亡

與Control組比較，Caerulein組胰腺腺泡細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Caerulein+Vector組比較，Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞存活率升高、凋亡率降低，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表2。

表1 各組胰腺腺泡細(xì)胞中GAS5的表達(dá)Tab.1 The expression of GAS5 in pancreatic acinar cells in each

2.3 GAS5和miR-135a的靶向關(guān)系

根據(jù)生物信息學(xué)軟件對靶基因的預(yù)測，可知GAS5和miR-135a有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC+WT組比較，miR-135a+WT組細(xì)胞螢光素酶活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-NC+MUT組比較，miR-135a+MUT組細(xì)胞螢光素酶活性無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表3。

表2 各組胰腺腺泡細(xì)胞存活率、凋亡率及C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平Tab.2 Survival rate, apoptotic rate,and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 of pancreatic acinar cells in each

表3 雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測miR-NC、miR-135a分別與WT、MUT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞螢光素酶活性Tab.3 Cellular luciferase activity detected by dual luciferase reporter assay after miR-NC or miR-135a co-transfected with WT , MUT,

2.4 miR-135a表達(dá)

與Control組比較，Caerulein組胰腺腺泡細(xì)胞中miR-135a表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Caerulein+Vector組比較，Caerulein+GAS5組胰腺腺泡細(xì)胞中miR-135a表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組胰腺腺泡細(xì)胞中miR-135a的表達(dá)Tab.4 The expression of miR-135a in pancreatic acinar cells in each

2.5 miR-135a mimcis的影響

與Caerulein+GAS5+miR-NC組比較，Caeru-lein+GAS5+miR-135a組胰腺腺泡細(xì)胞中miR-135a表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖3、圖4及表5。

表5 上調(diào)miR-135a對胰腺腺泡細(xì)胞的miR-135a水平、存活率、凋亡率、C-Caspase-3及C-Caspase-9蛋白表達(dá)的影響Tab.5 The effect of overexpressing miR-135a on cell survival rate, apoptotic rate,and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 in pancreatic acinar cells in each

3 討論

急性胰腺炎是一種復(fù)雜的炎癥反應(yīng)性疾病，起病兇險、病死率高，部分可發(fā)展成重癥急性胰腺炎，由于該病病情復(fù)雜，常累及多種組織器官，其治療仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；深入研究其發(fā)病機(jī)制，可為急性胰腺炎的臨床診斷及靶向治療提供新的方向[11-13]。眾多研究顯示，lncRNA對急性胰腺炎發(fā)揮著重要調(diào)控作用，可通過影響胰腺腺泡細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等影響急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[14-16]。GAS5是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)較早的調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，如敲低GAS5可有效抑制LPS誘導(dǎo)的敗血癥模型中的炎癥和細(xì)胞凋亡[17]；敲低GAS5可保護(hù)人類心肌細(xì)胞樣AC16細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的炎癥[18]；高糖處理的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中，GAS5過表達(dá)降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，GAS5能夠抑制炎癥誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[9]。Caerulein是常見的體外研究急性胰腺炎損傷的誘導(dǎo)因子，受其刺激，胰腺腺泡細(xì)胞會發(fā)生過度凋亡、增殖活性降低[20]。本研究以caerulein刺激胰腺腺泡細(xì)胞，結(jié)果顯示GAS5表達(dá)下調(diào)，提示GAS5可能與急性胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷有關(guān)。Caspase-9是凋亡起始因子，Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子，其活化后能夠激活細(xì)胞凋亡[21-23]。本研究進(jìn)一步過表達(dá)GAS5后，caerulein誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞的存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)減少，從而表明上調(diào)GAS5可抑制caerulein誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞增殖活性。因此，GAS5可能是一個胰腺炎保護(hù)因子，這對于分子靶向治療胰腺炎具有重要意義。

已有研究表明，GAS5可通過靶向miR-135a參與動脈粥樣硬化、癲癇等病理過程[24-25]。本研究結(jié)果提示，上調(diào)GAS5可靶向下調(diào)caerulein誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞中miR-135a表達(dá)水平，GAS5可通過作用于miR-135a參與胰腺炎進(jìn)展。miR-135a定位于人類3號染色體，有研究表明，miR-135a在胰腺炎中表達(dá)上調(diào)，沉默miR-135a可減少caerulein誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中Caspase-3的活化水平[10]。本研究在胰腺腺泡細(xì)胞中同時過表達(dá)GAS5和miR-135a后，miR-135a 可逆轉(zhuǎn)GAS5對caerulein誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而提示GAS5可能通過調(diào)控miR-135a發(fā)揮胰腺炎保護(hù)作用。

綜上，GAS5可能是胰腺炎未來的治療靶點(diǎn)，靶向下調(diào)miR-135a可減少caerulein誘導(dǎo)的急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡，然而本研究尚未對GAS5調(diào)控miR-135a的下游機(jī)制進(jìn)行探討，可考慮今后開展相關(guān)的后續(xù)研究。