王茂行，胡俊峰，李昌哲，左佩佩，何國志，胡婷，2***

( 1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

砷是國際癌癥研究組織認(rèn)定的Ⅰ類致癌物，主要以化合物形式存在，廣泛分布于水和土壤中[1]；砷也是人體微量元素之一，正常情況下不會對人體造成危害。但是，砷在體內(nèi)有蓄積性，砷攝入過量時(shí)極易在皮膚、指甲、毛發(fā)以及肝腎等組織和器官蓄積,造成DNA損傷、細(xì)胞凋亡、器官功能障礙導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和皮膚等發(fā)生病變[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，砷可在機(jī)體內(nèi)誘發(fā)活性氧自由基促使脂質(zhì)過氧化，刺激機(jī)體與肝臟損傷有關(guān)的目的基因表達(dá)，促使炎癥因子的異常表達(dá)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝臟損傷[3]。竹蓀又稱竹笙、竹參，是隸屬于鬼筆科竹蓀屬的一種食用菌。我國竹蓀種類主要分為短裙竹蓀、長裙竹蓀、紅托竹蓀和棘托竹蓀，其中紅托竹蓀和棘托竹蓀主要產(chǎn)地在云南、貴州和湖南。竹蓀成分主要包括多糖、多酚、黃酮、蛋白質(zhì)等具備生物活性的物質(zhì)[4]，具有健脾益胃[5]、降血脂[6]、抗凋亡[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、抗炎癥[10]等保健功能。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，通過建立砷致大鼠肝損傷模型，采用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察TNF-α、IL-6炎癥因子在組織中的表達(dá)，評價(jià)竹蓀多糖對砷中毒大鼠肝臟的抗炎性作用，為竹蓀多糖的藥用價(jià)值和醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級SD大鼠，30只，體質(zhì)量為80～100 g，雌雄各半，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SYXK(渝)2017～0002。

1.1.2主要試劑和儀器 亞砷酸鈉(優(yōu)級純，美國Sigma 公司) ，竹蓀多糖(本課題組采用水提醇沉法從竹蓀菌托中提取，提取率 15.98 %)，一抗IL-6(ab9324)、TNF-α(ab220210)，購自abcam公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)，含亞砷酸鈉飼料由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心制備。全自動生化分析儀( AU400，OLYMPUS 有限公司，日本)，Mlilli-Q超純水器(Millipore 公司，美國) ，μQuant Max200 超級酶標(biāo)儀(Bio-Tek 公司，美國) ，Z36HK 高速冷凍離心機(jī)(Hermle 公司，德國)，ZT-12P2 組織脫水機(jī)(上海華巖儀器設(shè)備有限公司，中國)，LEICA RM2135 旋轉(zhuǎn)式超薄切片機(jī)(徠卡公司，德國)，HI1220 徠卡烘片機(jī)(徠卡公司，德國) 及YT-6C 生物組織攤烤片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，中國) 。

1.2研究方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 大鼠經(jīng)過1周的檢疫后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成對照組、砷中毒組和竹蓀多糖組，每組10只。對照組采用正常飼料飼養(yǎng)，砷中毒組采用亞砷酸鈉飼料飼養(yǎng)(含砷50 mg/kg)，竹蓀多糖組采用亞砷酸鈉飼料飼養(yǎng)(含砷50 mg/kg)，同時(shí)在喂養(yǎng)第5個(gè)月后按20 mL/kg劑量，灌胃給予濃度為10 g/L的竹蓀多糖溶液，1次/d，持續(xù)灌胃30 d。所有動物均自由飲水、攝食，每周稱重并記錄。

1.2.2大鼠肝臟臟器系數(shù)的測定 染毒結(jié)束后，大鼠禁食 12 h 稱重，1% 戊巴比妥鈉按照 10 mg/kg麻醉大鼠，心臟取血后，迅速分離肝臟，稱重并計(jì)算肝臟系數(shù)。

1.2.3血生化檢測 通過心臟取血收集非抗凝血 4 mL，3500 r/min 離心 10 min，取血清檢測大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 水平。

1.2.4HE染色 各組大鼠肝組織標(biāo)本脫水、包埋、切片、脫蠟后HE染色：蘇木精3 min→流水5 min(顯微鏡下觀察蘇木精染色情況)→鹽酸酒精分化3 s→水洗1 min(顯微鏡下觀察蘇木精染色情況)→伊紅染色1 min→流水1 min→脫水封片，最后完成鏡檢。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠肝組織標(biāo)本經(jīng)脫水，包埋，切片、脫蠟后，置于3 %甲醇雙氧水10 min，PBS 洗3次，每次5 min，轉(zhuǎn)至0.01 mol/L檸檬酸緩沖液 (PH 6.0) 中，微波加熱至沸騰，重復(fù)2次，冷卻后經(jīng)PBS洗滌，依次滴加山羊血清封閉液(室溫20 min)，一抗(4 ℃過夜)，生物素化二抗(37 ℃，30 min)，PBS 水洗3次，每次5 min后DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠密封，最后鏡檢。

1.2.6圖像采集及光密度計(jì)算 采用BA200 Digital數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)先在100倍下觀察切片，再選取3個(gè)視野采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定光密度和面積，計(jì)算平均光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量

與對照組比較，砷中毒組大鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與砷中毒組比較，竹蓀多糖組大鼠體質(zhì)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1 。

2.2 肝臟臟器系數(shù)

與對照組比較，砷中毒組大鼠肝臟臟器系數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與砷中毒組比較，竹蓀多糖組大鼠肝臟臟器系數(shù)下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 血清ALT、AST水平

與對照組比較，砷中毒組大鼠血清中ALT和AST的含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與砷中毒比較，竹蓀多糖干預(yù)后ALT、AST均有所下降，但只有AST含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 肝組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，對照組的肝組織結(jié)構(gòu)正常、細(xì)胞邊界清晰、未見細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤增生等病理性改變；砷中毒組大鼠肝細(xì)胞邊界不清，肝臟結(jié)構(gòu)破壞、大量炎性細(xì)胞浸潤；竹蓀多糖組組織結(jié)構(gòu)較正常，細(xì)胞邊界清晰、排列稍有紊亂。見圖4。

2.5 肝臟IL-6及TNF-α表達(dá)

2.5.1IL-6的表達(dá) 如圖5所示，對照組大鼠肝臟中IL-6少量分布于細(xì)胞間質(zhì)；與對照組比較，砷中毒組大鼠肝臟內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)間均呈黃棕色，IL-6的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與砷中毒組比較，竹蓀多糖組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)呈黃色，IL-6的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5.2TNF-α的表達(dá) 如圖6 所示，TNF-α蛋白在對照組大鼠肝臟中表達(dá)水平較低。與對照組比較，砷中毒組大鼠細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)呈黃棕色，均呈現(xiàn)TNF-α的陽性表達(dá)，TNF-α表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與砷中毒組比較，竹蓀多糖組大鼠肝臟中TNF-α蛋白的表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

砷中毒臨床上以多臟器多系統(tǒng)損害為特點(diǎn)，并可最終發(fā)展為皮膚癌、肺癌、肝癌等[11]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝臟是砷在機(jī)體發(fā)揮毒性的主要靶器官之一，但具體作用機(jī)制不明，且無特效治療藥物，限制了砷的防治工作進(jìn)展[12]。因此，深入探索砷致肝損傷的發(fā)病機(jī)制，尋找切實(shí)有效的早期診斷標(biāo)志物和生物治療靶標(biāo)是目前防治砷暴露所致肝損傷的重要任務(wù)?，F(xiàn)有學(xué)說已證實(shí)砷中毒誘導(dǎo)的肝臟損傷與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[13]。竹蓀，是我省資源豐富的藥食兩用真菌，富含維生素、蛋白質(zhì)、多糖等活性物質(zhì)[14]。近年來發(fā)現(xiàn)其提取多糖具有調(diào)節(jié)免疫，抗腫瘤、抗氧化、降血脂、血糖等活性[11, 15-17]，在醫(yī)藥、食品方面具有巨大的開發(fā)利用價(jià)值，是天然活性物質(zhì)研究相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

本研究通過利用亞砷酸鈉建立砷中毒大鼠肝組織損傷模型，以竹蓀多糖進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化顯示，砷可以抑制大鼠體質(zhì)量的增加，而竹蓀多糖干預(yù)后在一定程度上改善了大鼠體質(zhì)量的下降。檢測血清中ALT和AST的含量顯示，砷暴露后大鼠血清中AST、ALT含量相較對照組均升高，提示肝臟發(fā)生損傷，而竹蓀多糖干預(yù)后，降低了AST、ALT的含量，損傷得到緩解。以HE染色觀察肝損傷情況，結(jié)果顯示，砷暴露引起肝組織結(jié)構(gòu)的破壞，引發(fā)炎細(xì)胞浸潤增生，竹蓀多糖可以在一定程度上改善損傷情況。以上結(jié)果均表明，我們利用亞砷酸鈉成功誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型，竹蓀多糖干預(yù)可拮抗砷對肝臟的損傷作用。

腫瘤壞死因子(TNF-α)又稱惡液質(zhì)素，是 B 細(xì)胞和單個(gè)吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物活性細(xì)胞因子，參與許多生理和病理過程，如免疫、抗炎、抗感染、抗腫瘤，可直接殺死癌細(xì)胞，其具備強(qiáng)大的抗癌能力[18]，但因具有嚴(yán)重毒副作用未能應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā)。其可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1，增加腫瘤壞死因子自身表達(dá)損害機(jī)體組織[19]。IL-6是一種功能廣泛的多效性因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化以及參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，在機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中有至關(guān)重要的作用[20]。在產(chǎn)生炎癥反應(yīng)過程中IL-6會快速生成，臨床上手術(shù)病人的IL-6濃度能夠預(yù)測是否會伴隨并發(fā)癥的產(chǎn)生[21]。

在機(jī)體正常情況下細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)、分泌受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控維持在正常水平并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，炎癥反應(yīng)作為一種抵抗外來物對機(jī)體刺激的主要方式，對維持機(jī)體的正常功能有著重要作用，當(dāng)外來物刺激機(jī)體或產(chǎn)生病變時(shí)，機(jī)體不能及時(shí)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或者機(jī)體炎癥反應(yīng)過度都可對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，表現(xiàn)為癌癥在內(nèi)的多種疾病。本研究通過組織免疫化學(xué)法檢測大鼠肝臟中炎癥因子TNF-α及IL-6的表達(dá)，結(jié)果顯示，砷暴露上調(diào)大鼠肝組織中TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)，而竹蓀多糖可以拮抗TNF-α、IL-6的上調(diào)。說明砷暴露打破了機(jī)體炎癥平衡，可能通過改變TNF-α和IL-6的蛋白表達(dá)激發(fā)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，繼而導(dǎo)致肝臟損傷，而竹蓀多糖可以通過抑制TNF-α和IL-6蛋白的上調(diào)，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，砷暴露可以誘導(dǎo)大鼠肝臟損傷，這種損傷可能與其激發(fā)炎癥反應(yīng)有關(guān)，而竹蓀多糖可以通過下調(diào)肝臟中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)發(fā)揮一定的保護(hù)作用，但竹蓀多糖具體的抗炎機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探索。