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CD133+與CD133-人原代胃癌細胞的差異表達基因及核心基因的篩選*

2022-03-31 08:27賈岑岑程薇李雷蕾曾曉燕廖永慧謝淵周建獎趙艷
貴州醫(yī)科大學學報 2022年2期
關鍵詞:原代亞基胃癌

賈岑岑, 程薇, 李雷蕾, 曾曉燕, 廖永慧, 謝淵, 周建獎, 趙艷

(貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室, 貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球第5大常見癌癥,亦是死亡率第4位的惡性腫瘤[1]。目前,胃癌具體的發(fā)病機制尚未完全明確,其發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合的結果,包括幽門螺桿菌感染、遺傳因素、飲食習慣、飲酒以及吸煙等[2-4]。隨著對腫瘤發(fā)病機制的認識和研究不斷深入,腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)學說對探索新的腫瘤治療方式具有重要意義[5]。目前已知的大多數(shù) CSC 表面標記都來自已知的胚胎或成人干細胞表面標記,以此來識別癌癥組織中CSC[6]。CD133是具有5次跨膜結構的糖蛋白,也是近年來研究較多的腫瘤干細胞標志物。有研究顯示,CD133在胃癌中的過度表達與淋巴結轉移、化學耐受性以及血管浸潤相關,且患者的預后較差[7-11]。CD133在胰腺癌、肺癌、肝癌、腦腫瘤等多種腫瘤組織中均有表達[12-15],且與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。為了研究CD133陽性胃癌干細胞中的關鍵基因與通路,本研究利用前期分選出的CD133+與CD133-原代胃癌細胞轉錄組學數(shù)據(jù),應用生物信息學分析兩者之間的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs),結合Cytoscape 3.8.0、GEPIA、ULCAN和Metascape構建基因的蛋白網(wǎng)絡圖,篩選關鍵靶點基因和相關通路,旨在探索參與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的潛在核心基因,為CD133+胃癌干細胞與胃癌的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預后提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

CD133+與CD133-人原代胃癌細胞由課題組前期分選鑒定,保存于液氮罐中;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶購于美國Gibco公司,倒置顯微鏡購自日本Olympus公司,細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司,超凈工作臺購于蘇州市金凈凈化設備科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1數(shù)據(jù)收集及DEGs篩選 課題組前期通過華大基因科技有限公司對CD133+與CD133-人原代胃癌細胞進行轉錄組測序,本次研究通過R語言(4.0.4版本)Affy程序包對轉錄組原始數(shù)據(jù)進行過濾和標準化處理,再運用limma安裝包篩選得到DEGs,以|log2FC|≥1和P<0.05作為篩選標準,對DEGs繪制火山圖和聚類熱圖,直觀地展示基因表達情況。

1.2.2基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析 利用生物信息注釋數(shù)據(jù)庫Metascape (http://metascape.org/),以P<0.05為標準,篩選DEGs的GO富集結果和KEGG信號通路分析結果。GO功能富集包含生物過程(biological process, BP)、細胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)3個方面。

1.2.3蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡構建與核心基因的篩選 應用在線數(shù)據(jù)庫STRING(http//string-db.org/),以medium confidence>0. 4為條件來構建CD133+與CD133-人原代胃癌細胞DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡,并通過Cytoscape3.8.2軟件(http://www.cytoscape.org/)將PPI網(wǎng)絡可視化,利用CytoHubba插件計算各節(jié)點間的數(shù)值,并使用MCODE插件從PPI網(wǎng)絡中選取最重要的模塊進行分析,篩選出核心基因。

1.2.4核心基因與臨床患者總生存率的關系分析 利用腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA) 數(shù)據(jù)庫,通過在線網(wǎng)站Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析核心基因與臨床胃癌患者總生存率的關系,篩選條件:(1)癌癥,胃癌; (2)基因,見表1;(3)生存期,總生存期;(4)閾值,All; (5)患者,自動選擇最佳。評估核心基因在預測胃癌患者預后中的價值。

2 結果

2.1 DEGs的篩選

經(jīng)R語言limma安裝包分析,按照|log2FC|≥1,P<0.05為篩選閾值,在CD133+和CD133-人原代胃癌細胞中共篩選出305個DEGs,其中在CD133+細胞中下調的DEGs 227個,上調的DEGs 78個。見圖1。

2.2 GO富集與KEGG通路富集

GO富集以P<0.01,以最小重疊基因=3和最小富集因子>1.5作為閾值,分別對78個上調DEGs和227個下調DEGs進行分析,圖2結果顯示:上調的DEGs主要參與信號轉導受體活性調節(jié)、細胞黏附、rho蛋白信號轉導調節(jié)的生物過程、鈣離子通道調節(jié)以及鈣離子跨膜轉運蛋白活性調節(jié)等分子功能;下調的DEGs主要參與DNA復制、DNA代謝、ncRNA代謝的生物過程、甲基轉移酶活性、單鏈DNA螺旋酶活性以及乙酰轉移酶活性等分子功能。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于IL-17信號通路、破骨細胞的分化、RNA運輸以及MAPK信號通路等。見圖3。

2.3 PPI構建與核心基因的篩選

PPI圖中共有187個節(jié)點,連接線362個,見圖4。應用CytoHubba插件計算各節(jié)點間的數(shù)值,MCODE插件分析PPI網(wǎng)絡中連接最緊密的基因模塊,從中選取分數(shù)排名前3的模塊,見圖5;根據(jù)度值評分篩選出前20的基因即核心基因,見表1。

2.4 核心基因與胃癌患者總生存率分析

分析20個核心基因與臨床胃癌患者總生存率的關系,發(fā)現(xiàn)趨化因子8(C-X-Cmotifchemokine8,CXCL8)(HR=0.65)、TCP1伴侶蛋白亞基2(chaperonincontainingTCP1,subunitβ,CCT2) (HR=0.76)、核糖體產(chǎn)物因子 2(ribosomeproductionfactor2,RPF2)(HR=0.77)、蛋白酶體 20S 亞基α4(proteasome20Ssubunitalpha4,PSMA4)(HR=0.56)、胞質伴侶素6A(chaperonincontainingTCP1subunit6A,CCT6A)(HR=0.74)、蛋白酶體 26S 亞基(proteasome26Ssubunit,non-ATPase12,PSMD12)(HR=0.63)以及凝聚素Ⅰ復合物亞基G(non-SMCcondensinIcomplexsubunitG,NCAPG)(HR=0.63)基因表達與總生存率負相關(P<0.05);RUNX 家族轉錄因子2(RUNXfamilytranscriptionfactor2,RUNX2)(HR=1.51)與總生存率正相關(P<0.05)。圖6。

表1 PPI網(wǎng)絡中前20的核心基因Tab.1 Top 20 core genes in the PPI network

3 討論

胃癌仍然是全球癌癥死亡的重要原因,死亡率很高。CSC是具有干細胞特征的癌細胞,占整個腫瘤的極少部分,它們具有自我更新和分化能力,被認為是腫瘤復發(fā)和轉移的起源。研究表明,CD133作為CSC標志物可以在多種實體瘤中調節(jié)細胞自我更新和腫瘤發(fā)生。因此,進一步基于CD133尋找針對胃癌新的分子標記物,了解胃癌的發(fā)展進程和分子機制對于胃癌患者的治療和預后至關重要。

本研究基于課題組前期分選出的CD133+與CD133-人原代胃癌細胞轉錄組學數(shù)據(jù),篩選出CD133+與CD133-原代胃癌細胞之間的DEGs 305個,其中表達下調的DEGs 227個,上調的DEGs 78個。GO功能富集分析顯示DEGs主要參與鈣離子通道調節(jié)、DNA的復制以及DNA的代謝過程等;KEGG通路富集提示DEGs主要富集于IL-17信號通路、RNA運輸以及MAPK信號通路;基于Metascape的GO分析工具,上調的DEGs與信號傳導受體活性的調節(jié)、細胞粘附以及rho蛋白信號轉導的調節(jié)、鈣離子通道調節(jié)及鈣離子跨膜轉運蛋白活性有關。下調DEGs主要在DNA復制、DNA的代謝過程、ncRNA代謝、甲基轉移酶活性、單鏈DNA螺旋酶活性和乙酰轉移酶活性以及細胞內的蛋白絡合物富集。通過構建DEGs的PPI網(wǎng)絡,并篩選出20個核心基因,其中CCT2、CCT6A、RPF2、PSMA4、PSMD12、NCAPG和RUNX2與胃癌患者的預后相關,以上8個關鍵基因中除RUNX2在CD133+中上調與總生存率正相關,其余七個基因在CD133+中皆表達下調,且表達與總生存率負相關,提示以上基因與胃癌患者的預后密切相關。

CCT參與細胞中的蛋白質折疊,調節(jié)許多腫瘤相關蛋白質的表達和細胞周期,每個環(huán)有8個不同的亞基構成,其中 CCT2是CCT的β亞基。既往研究發(fā)現(xiàn)CCT2在乳腺癌、膽囊癌、腸癌及肝癌中高表達,且CCT2的表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移以及患者預后密切相關[20-21],CCT2在幫助折疊作用素、管蛋白和其他細胞溶性蛋白方面起關鍵作用[22-23]。CCT6A則是CCT的第六個亞基的a亞型,CCT6A被發(fā)現(xiàn)在調節(jié)幾種癌癥的進展中起重要的作用[24]。 CCT6A能促進非小細胞癌細胞生存和轉移,調節(jié)肝細胞癌細胞和乳腺癌細胞的細胞周期[25-26]。目前CCT2、CCT6A與胃癌之間的研究較少。RNA結合蛋白在rRNA處理和防止錯誤折疊rRNA的形成方面起重要作用。RPF2是一個RNA結合蛋白,它能與核糖體合成調控因子1相互作用后影響60S核糖體亞單位的生物合成[27]。目前尚未見RPF2在腫瘤中的研究。PSMA4 是20S蛋白酶核心的α亞基,控制蛋白酶體的活性。已有研究表明PSMA4的缺失會降低蛋白酶體的活性,導致蛋白質的積累,影響轉錄、細胞周期進展以及凋亡中涉及的蛋白質的降解。因此,若PSMA4缺失則會導致蛋白酶體功能障礙對細胞造成壓力[28]。肺癌中PSMA4在癌細胞增殖起著重要的作用,下調會誘發(fā)癌細胞凋亡[29],但其在胃癌和其他腫瘤中的作用尚未涉及。PSMD12則是26S蛋白酶復合物的19S調節(jié)因子的非ATPase亞基,可以去除錯誤折疊或受損的蛋白質來調節(jié)細胞周期、DNA損傷修復和凋亡。PSMD12在多種腫瘤中高表達并能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其在乳腺癌中能夠促進細胞的生長和遷移并抑制凋亡[30];在膠質瘤中被認為是腫瘤發(fā)展和進展的關鍵調節(jié)器,可作為治療膠質瘤的潛在生物標志物或治療靶點[31]。目前PSMD12在胃癌中的研究尚未見報道。Runt相關轉錄因子 (RUNX) 蛋白屬于轉錄因子家族,被稱為重要胚胎發(fā)育程序的主要調節(jié)因子,參與細胞的增殖、分化和細胞凋亡[32]。在哺乳動物中RUNX家族有3個成員,分別是RUNX1、RUNX2和RUNX3,其中RUNX2對成骨至關重要[33]。既往研究發(fā)現(xiàn)RUNX2在乳腺癌[34]、肺癌[35]、神經(jīng)膠質瘤[36]、結直腸癌[37]等多種腫瘤中過度表達并提示預后不良。越來越多的證據(jù)表明 RUNX2在腫瘤的發(fā)生、進展、侵襲和轉移中起著至關重要的作用。RUNX2參與了胃癌的侵襲和轉移,與胃癌臨床病理參數(shù)和患者的預后密切相關[38]。

綜上所述, 本研究利用生物信息學篩選出CD133+與CD133-人原代胃癌細胞之間的305個DEGs,成功構建DEGs的PPI網(wǎng)絡,篩選出可能參與胃癌發(fā)生的20個關鍵基因,其中CCT2、RPF2、PSMA4、CCT6A、PSMD12、NCAPG和RUNX2與胃癌的預后相關。本研究將為胃癌干細胞的分子機制及胃癌治療提供新的靶點。

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