張晗， 陳婷， 陳暢， 唐李娟， 陳瑩瑩， 鐘琦， 張宗澤

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院 麻醉科， 湖北 武漢 430071)

機(jī)械通氣是危重癥患者呼吸道管理的重要手段，可導(dǎo)致機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)和包括腦在內(nèi)的遠(yuǎn)隔器官功能障礙[1]。自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種自我保護(hù)機(jī)制，用于隔離和降解細(xì)胞溶質(zhì)大分子和受損細(xì)胞器，最近的研究證實(shí)巨噬細(xì)胞自噬參與炎癥反應(yīng)的精細(xì)控制[2]。Nod樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，可觸發(fā)效應(yīng)蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)的激活從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β和IL-18的成熟和釋放，并引起炎癥反應(yīng)[3]。本課題組前期研究證實(shí)，機(jī)械通氣6 h后即刻小鼠腦組織自噬水平增強(qiáng)[4]；也有研究表明，機(jī)械通氣時(shí)NLRP3炎癥小體被激活，可放大肺部炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]；創(chuàng)傷性腦損傷模型中，NLRP3炎癥小體會(huì)被激活[6]，同時(shí)阻斷自噬增強(qiáng)了 NLRP3炎癥小體通路的激活[7]。對(duì)自噬調(diào)控NLRP3炎癥小體在機(jī)械通氣致認(rèn)知障礙中的作用值得探討，本研究擬評(píng)價(jià)機(jī)械通氣導(dǎo)致小鼠認(rèn)知障礙時(shí)對(duì)自噬和NLRP3炎癥小體的影響，為明確其機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)分組與處理 SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠110只，8～12周齡，體質(zhì)量20～25 g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。110只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組(C組，n=26)、機(jī)械通氣組(MV組，n=28)、機(jī)械通氣+雷帕霉素處理組(Rap組，n=28)、機(jī)械通氣+6-氨基-3-甲基嘌呤處理組(3-MA組，n=28)，MV組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g麻醉后機(jī)械通氣6 h；Rap組和3-MA組小鼠在機(jī)械通氣前1 h分別給予0.001 mg/g自噬激動(dòng)劑PaP和0.015 mg/g自噬抑制劑3-MA、再腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g麻醉后機(jī)械通氣6 h，C組小鼠腹腔注射等量1%戊巴比妥后自主呼吸6 h。

1.1.2主要試劑及儀器 TOPOTM動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)Kent Scientific公司)，PhysioSuite動(dòng)物血氧監(jiān)控儀(美國(guó)Kent Scientific公司)，22 G靜脈留置針(美國(guó) B.Brun Melsungen公司)，雷帕霉素(美國(guó)Selleck公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(美國(guó)Selleck公司)，SuperMaze 曠場(chǎng)動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)，水迷宮動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(上海吉良軟件科技公司)，倒置相差顯微鏡和普通正置顯微鏡(日本Olympus公司)；抗體、NLRP3一抗、凋亡相關(guān)微粒蛋白(advanced synthesis & catalysis，ASC)一抗和離子鈣接頭蛋白抗原(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，IBA-1)一抗(美國(guó)abcam公司)、自噬相關(guān)蛋白p62一抗和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)一抗(美國(guó)CST公司)、Caspase-1一抗(美國(guó)santa公司)，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(美國(guó)Aspen公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液(中國(guó)Aspen公司)，4%多聚甲醛緩沖液(碧云天生物有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠機(jī)械通氣模型的制備[8]腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g，待小鼠翻正反射消失，仰臥位固定，取頭高后肢低位，用鑷子將舌頭推向一側(cè)，然后用自制弧形壓舌板將舌頭向上提拉暴露聲門(mén)，同時(shí)，將照射燈垂直照射于頸部聲門(mén)處，22 G靜脈留置針插入氣管內(nèi)，拔除針芯，確定雙肺通氣良好，膠布固定，連接TOPOTM動(dòng)物呼吸機(jī)，采用壓力控制模式進(jìn)行機(jī)械通氣，吸入氧濃度50%，通氣頻率130次/min，吸氣峰壓13～15 cmH2O(1 cmH2O=0. 098 kPa)，連接PhysioSuite動(dòng)物血氧監(jiān)控儀測(cè)脈搏血氧飽和度和脈率。根據(jù)通氣情況，追加戊巴比妥維持麻醉，每2 h腹腔注射乳酸林格溶液0.1 mL；機(jī)械通氣6 h，氣管拔管后觀察無(wú)異常放回籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 于機(jī)械通氣結(jié)束后第1 和第3天，每組取8只小鼠，參照文獻(xiàn)[9]的方法行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析箱為有機(jī)板制成白色無(wú)頂不透明的空箱(40 cm×40 cm×40 cm)，四壁涂黑，將其分為16(4×4)個(gè)大小均等的方格，中間的4個(gè)方格為中央?yún)^(qū)。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物在測(cè)試房間適應(yīng)10 min以上。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每只小鼠均從中間放入空箱中，允許其在箱中自由探索5 min，采用視頻監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)(SuperMaze 系統(tǒng)分析軟件)記錄運(yùn)動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、跨格次數(shù)。實(shí)驗(yàn)后用75%酒精擦拭實(shí)驗(yàn)箱，以避免殘留氣味對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)小鼠的影響。

1.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 于機(jī)械通氣結(jié)束后第1 天，每組取8只小鼠，參照文獻(xiàn)[10]的方法行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。圓形水池直徑120 cm，高60 cm，平臺(tái)高50 cm，直徑10 cm，水池內(nèi)注水使平臺(tái)低于水面1 cm，屏蔽劑為脫脂奶粉。水池分為4個(gè)象限，選擇其中一個(gè)象限作為目標(biāo)象限并置入平臺(tái)，水池中心上方1.5 m處放置攝像機(jī)用于追蹤小鼠游泳路徑。水迷宮實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6 d，第1～5天為定向航行實(shí)驗(yàn)：小鼠分別從水池4個(gè)對(duì)稱位置面向池壁入水，間隔20 min開(kāi)始下一個(gè)象限，記錄每次入水到找到平臺(tái)的時(shí)間，若60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其找到平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留15 s，時(shí)間記為60 s，取4次測(cè)試結(jié)果的平均值為逃避潛伏期；第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)：去除平臺(tái)，將小鼠頭朝池壁從原平臺(tái)象限對(duì)側(cè)緩慢放入水中，記錄60 s內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡，記錄目標(biāo)象限停留時(shí)間，計(jì)算目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。

1.2.4Western blot檢測(cè) 于機(jī)械通氣結(jié)束后第1和第3 天，每組取6只小鼠，戊巴比妥麻醉后斷頭冰上取腦，再分離雙側(cè)海馬組織，放入液氮保存。采用Western blot法檢測(cè)p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1。取液氮凍存的海馬組織，加入相應(yīng)體積裂解液，勻漿后離心，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品加入樣品孔中，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，分離蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下封閉液孵育1 h，分別加入內(nèi)參GADPH抗體 (1 ∶10 000)、p62一抗 (1 ∶1 000)、LC3一抗(1 ∶1 000)、NLRP3一抗(1 ∶500)、Caspase-1一抗(1 ∶500)、ASC一抗(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次15 min，洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育30 min，TBST室溫?fù)u床洗4次，每次5 min，暗室內(nèi)加入顯色發(fā)光液曝光、掃描。采用Image J軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行分析光密度值，并計(jì)算p62、NLRP3、Caspase-1、ASC與內(nèi)參GADPH的比值和LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ表達(dá)的比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)，以反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5免疫熒光檢測(cè) 于機(jī)械通氣結(jié)束后第1和第3 天，每組隨機(jī)取4只小鼠，戊巴比妥麻醉后固定，暴露心臟，將灌注裝置的針尖插入小鼠左心室，剪開(kāi)右心耳，生理鹽水沖凈血液，然后用冰的4%多聚甲醛灌注小鼠，灌注成功標(biāo)志為小鼠尾巴翹起，取小鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)冠狀面切片3張，片厚5 μm。石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脫蠟復(fù)水后，置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)。切片經(jīng)PBS漂洗3次、每次5 min，正常山羊血清室溫封閉1 h，PBS漂洗后，加入一抗IBA-1抗體(1 ∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)的FITC標(biāo)記的IgG二抗(1 ∶100)，室溫孵育50 min，PBS洗滌3次、每次5 min，DAPI染液室溫避光孵育5 min后PBS漂洗3次、每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，在BX-51熒光顯微鏡下觀察、拍片。在海馬CAl區(qū)采集各指標(biāo)免疫熒光圖像，并觀察細(xì)胞形態(tài)，離子鈣接頭蛋白-1(IBA-1)呈紅色熒光，采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平。每只小鼠隨機(jī)切取3張切片，每張切片3個(gè)視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間及跨格次數(shù)

與C組比較，MV組小鼠各時(shí)點(diǎn)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，跨格次數(shù)減少(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時(shí)點(diǎn)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間縮短，跨格次數(shù)增加(P<0.05)，3-MA組各時(shí)點(diǎn)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，跨格次數(shù)減少(P<0.05)。各組小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組小鼠機(jī)械通氣結(jié)束后各時(shí)點(diǎn)的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Comparison of the results of the open field experiment at each time point after the mechanical ventilation of the four groups of

2.2 逃避潛伏期與目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比

與C組比較，MV組小鼠各時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比降低(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期縮短、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比升高(P<0.05)，3-MA組小鼠各時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期延長(zhǎng)、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比降低(P<0.05)。見(jiàn)表2和表3。

表2 四組小鼠機(jī)械通氣結(jié)束后第1天逃避潛伏期和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比Tab.2 Comparison of the 1st day escape latency and the percentage of stay time in the target quadrant after the end of mechanical ventilation in the four groups of

表3 四組小鼠機(jī)械通氣結(jié)束后第3天逃避潛伏期和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比的比較Tab.3 Comparison of the 3rd day escape latency and the percentage of stay time in the target quadrant after the end of mechanical ventilation in the four groups of

2.3 海馬組織自噬相關(guān)蛋白p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)

與C組比較，MV組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)增加、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)降低(P<0.05)，3-MA組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4 海馬 NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)

與C組比較，MV組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)降低，3-MA組各時(shí)點(diǎn)海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖2。

2.5 海馬小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1的表達(dá)

與C組比較，MV組小鼠各時(shí)點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時(shí)點(diǎn)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，3-MA組小鼠各時(shí)點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

機(jī)械通氣是一種至關(guān)重要的生命支持工具，但它也可能對(duì)肺、膈肌和大腦等遠(yuǎn)端器官造成損傷，有證據(jù)表明機(jī)械通氣是腦損傷的促成因素，通過(guò)誘發(fā)全身炎癥或改變與神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡相關(guān)的迷走神經(jīng)信號(hào)導(dǎo)致認(rèn)知障礙[11]。自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，自噬可負(fù)向調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活，應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可促進(jìn)自噬誘導(dǎo)，增加NLRP3炎癥小體降解[12]。有研究提出在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中330 min為長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣[13]，也有研究表明90 min高氣道壓機(jī)械通氣就可通過(guò)迷走多巴胺通過(guò)發(fā)揮作用引起海馬凋亡發(fā)生率增加[13]。前期研究證實(shí)，小鼠機(jī)械通氣6 h，可引起海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致早期學(xué)習(xí)記憶功能下降[14]，因此本研究選擇機(jī)械通氣時(shí)間為6 h。術(shù)后長(zhǎng)期機(jī)械通氣的患者急性腦功能障礙通常發(fā)生在機(jī)械通氣結(jié)束后1～3 d[15]，因此本研究在機(jī)械通氣后第1和第3天評(píng)價(jià)海馬炎癥反應(yīng)。參照文獻(xiàn)[16-17]選擇3-MA的劑量為0.015 mg/g，RaP的劑量為0.001 mg/g，于機(jī)械通氣前1 h腹腔注射。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)動(dòng)物自主行為、探索行為及緊張度[18]，主要觀察動(dòng)物在開(kāi)闊環(huán)境中的行為學(xué)變化。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)齲齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典方法，主要包括定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)[19]。本研究結(jié)果顯示，小鼠機(jī)械通氣6 h后中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，跨格次數(shù)減少，運(yùn)動(dòng)總路程差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示小鼠探索行為減少，對(duì)新環(huán)境認(rèn)知能力降低，但運(yùn)動(dòng)能力無(wú)明顯變化；逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比降低，提示小鼠海馬相關(guān)記憶功能減退。以上結(jié)果表明，機(jī)械通氣小鼠認(rèn)知障礙模型制備成功。與MV組比較，Rap組各時(shí)點(diǎn)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間縮短，跨格次數(shù)增加，逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比升高；3-MA組各時(shí)點(diǎn)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，跨格次數(shù)減少，逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比降低，提示自噬激動(dòng)劑RaP減輕了機(jī)械通氣導(dǎo)致的腦損傷，自噬抑制劑3-MA加重了機(jī)械通氣導(dǎo)致的腦損傷。

機(jī)械通氣時(shí)導(dǎo)致的神經(jīng)認(rèn)知障礙主要是基于肺腦交互機(jī)制，外周(肺)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)之間通過(guò)體液、神經(jīng)和細(xì)胞這3條途徑進(jìn)行溝通。體液途徑即在肺中募集的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞增加了炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-1β，這些介質(zhì)可以通過(guò)體液途徑室周器官(OCV)直接到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而無(wú)需穿過(guò)血腦屏障(BBB)，還有其他主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制會(huì)在大腦水平產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮；神經(jīng)途徑即迷走神經(jīng)通路的傳入通過(guò)孤束核(NTS)到達(dá)大腦；細(xì)胞途徑即由肺中的TNF-α直接調(diào)節(jié)，這會(huì)刺激大腦水平的單核細(xì)胞-1(MCP-1)的釋放，反過(guò)來(lái)又能夠增加CNS和外周激活單核細(xì)胞的募集[20]。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，是系列炎癥反應(yīng)的核心。NLRP3炎癥小體的降解可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少炎性介質(zhì)的分泌，在神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮作用[21]。有研究表明，大潮氣量機(jī)械通氣急性期促發(fā)肺部異常自噬活躍，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)過(guò)度上調(diào)，肺泡巨噬細(xì)胞形成自噬小體增多，激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致肺組織病理?yè)p傷增加，IL-1β等炎癥介質(zhì)表達(dá)增加[16]。有研究表明，慢性腦缺血損傷誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活，阻斷自噬可能有助于激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步加劇神經(jīng)炎癥的發(fā)生[7]。在阿爾茨海默病中，小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬激活可降解和清除細(xì)胞外β-樣淀粉蛋白，并調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活[22]。本研究中，與C組相比，MV組各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)增加，提示機(jī)械通氣可能通過(guò)激活NLRP3炎癥小體導(dǎo)致小鼠的神經(jīng)認(rèn)知障礙。與MV組相比，Rap組各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)降低；3-MA組各時(shí)點(diǎn)海馬組織p62表達(dá)降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)增加，提示RaP通過(guò)增強(qiáng)自噬減輕了機(jī)械通氣導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，3-MA通過(guò)抑制自噬加重了這種炎癥反應(yīng)。

IBA-1在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞表面，激活小膠質(zhì)細(xì)胞可大幅上調(diào)IBA-1表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活是神經(jīng)炎癥的標(biāo)志，持續(xù)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能會(huì)促進(jìn)NLRP3炎癥小體的過(guò)度激活[23]。研究表明，外周炎癥刺激激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化參與膿毒癥所致譫妄[24]。本課題組前期研究證實(shí)，MV激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞、引起凋亡級(jí)聯(lián)通路，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[25]。本研究中，與C組比較，MV組各時(shí)點(diǎn)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加；與MV組比較，Rap組各時(shí)點(diǎn)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，3-MA組各時(shí)點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，提示機(jī)械通氣過(guò)程中自噬增加、NLRP3炎癥小體激活可能與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。

綜上所述，機(jī)械通氣可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了機(jī)械通氣相關(guān)性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可能與自噬水平減弱及NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。增強(qiáng)自噬可通過(guò)增加NLRP3炎癥小體的降解來(lái)減輕這種炎癥反應(yīng)，從而改善認(rèn)知障礙。