（湛江海關(guān)技術(shù)中心，廣東湛江 524000）

近年來(lái)，環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）應(yīng)用發(fā)展迅速，目前已被廣泛應(yīng)用于食品微生物、生物監(jiān)測(cè)、群落生態(tài)學(xué)、古環(huán)境研究、保護(hù)生物學(xué)和入侵生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域[1]。結(jié)合現(xiàn)代測(cè)序工具，基于eDNA 的研究提供了一種非侵入性方法，來(lái)識(shí)別與DNA 環(huán)境相關(guān)的物種或群落，成為保護(hù)和入侵生物學(xué)的可靠工具，發(fā)表的有關(guān)研究數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[2]。隨著人們對(duì)eDNA 的關(guān)注，越來(lái)越多的研究人員加入了這個(gè)行列，相關(guān)科學(xué)問(wèn)題、批評(píng)和創(chuàng)新也開(kāi)始展現(xiàn)出來(lái)。本文從eDNA 定義、歷史發(fā)展、研究方法和步驟以及用途、存在問(wèn)題和發(fā)展前景等方面，全面闡述了eDNA應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 定義

eDNA 是環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)的，許多不同生物體基因組DNA 的復(fù)雜混合物[3]。環(huán)境樣本包括土壤、沉淀物、水甚至糞便，也包括過(guò)濾空氣或水、過(guò)濾沉積物或大塊狀樣品所產(chǎn)生的物質(zhì)。在這種情況下，eDNA 對(duì)應(yīng)于從環(huán)境樣本中提取的DNA，目的是基于DNA 樣品為所研究的體系，獲得盡可能全面的分類(lèi)或功能信息。eDNA 包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA[4-5]。細(xì)胞內(nèi)DNA 來(lái)源于環(huán)境樣品中存在的活細(xì)胞或活多細(xì)胞生物；細(xì)胞外DNA 是細(xì)胞死亡和隨后細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的結(jié)果，可以通過(guò)物理、化學(xué)或生物過(guò)程降解。

目前，eDNA研究可分為兩大類(lèi)：靶向目標(biāo)性（物種特異性）和半靶向目標(biāo)性（群落）[6]。這兩個(gè)類(lèi)別經(jīng)常同時(shí)討論，但在方法、解釋和準(zhǔn)確性上有很大不同。物種特異性研究是針對(duì)特定物種的分析，主要針對(duì)環(huán)境樣本中的特定DNA 片段。該類(lèi)研究既可以集中在單一物種上，也可以利用一組分析方法對(duì)單一環(huán)境樣品進(jìn)行分析。eDNA 既可以通過(guò)分類(lèi)和基因測(cè)序來(lái)確定病原微生物DNA，也可以直接通過(guò)物種特異PCR 方法來(lái)檢測(cè)病原微生物，而不需要培養(yǎng)，對(duì)于難于增殖培養(yǎng)的微生物，eDNA 有獨(dú)特的意義。環(huán)境中的微生物是eDNA 的常規(guī)研究目標(biāo)，僅通過(guò)鳥(niǎo)槍?zhuān)╯hotgun sequencing）測(cè)序，無(wú)需任何靶向PCR，也可以進(jìn)行基因組的功能特性研究[7]。

2 發(fā)展史

eDNA 研究始于1987 年，Ogram 等[8]提 出關(guān)于沉積物中eDNA 提取方法的研究。1990 年，Giovannoni 等[9]首次提出宏基因組編碼（DNA metabarcoding），采用PCR 和克隆方法，研究分析了馬尾藻海浮游細(xì)菌中16s rRNA 基因的多樣性。宏基因組學(xué)始于1998 年，Handelsman 等[10]通過(guò)克隆和測(cè)序土壤中的eDNA 片段，以尋求在未培養(yǎng)的微生物中合成生物活性分子的新途徑。21世紀(jì)初，以克隆為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)和宏基因組編碼在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用非常普遍。Willerslev 等[11]利用DNA 宏基因組編碼對(duì)古代eDNA 進(jìn)行分析，這也開(kāi)始成為了解過(guò)去群落的一種非常有吸引力的方法。對(duì)于eDNA 分析研究學(xué)者來(lái)說(shuō)，無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)層面還是生物信息學(xué)層面，一些技術(shù)仍然具有挑戰(zhàn)性。

初期的eDNA 的基因編碼研究依賴(lài)于克隆。方法是先從復(fù)雜的混合物中分離出單個(gè)DNA 片段，再將DNA 片段插入克隆載體（如質(zhì)?；蚴删w）中，使其能夠在合適宿主（如大腸桿菌）的細(xì)胞中分離和增殖。第二代測(cè)序技術(shù)研究發(fā)展之后，進(jìn)一步刺激了宏基因組學(xué)研究的發(fā)展，省去了昂貴而耗時(shí)的克隆步驟[12]。之后，eDNA 基因組編碼的應(yīng)用擴(kuò)展到大型生物。首先是將糞便作為DNA 來(lái)源進(jìn)行飲食分析，然后是進(jìn)行水和土壤等eDNA 研究。關(guān)于淡水大型生物的eDNA 分析的研究很多，有涉及單一物種鑒定的，也有通過(guò)宏基因組編碼識(shí)別多個(gè)分類(lèi)群的[13-14]。

3 主要研究方法和步驟

3.1 主要方法

鑒定eDNA 樣本中存在的各種目標(biāo)分類(lèi)群，主要使用兩種方法：PCR 和DNA 宏基因組編碼。

PCR 方法中，最基礎(chǔ)的方法是普通PCR 擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)或定量PCR（qPCR）[15-16]。從復(fù)雜混合物中擴(kuò)增特定DNA 基因條形碼是基于eDNA 單一物種檢測(cè)的核心，可以采用普通PCR 或qPCR[17]。這兩種方法都能揭示環(huán)境樣品中目標(biāo)DNA 序列的存在。然而，qPCR 比普通PCR 更具信息性。普通PCR 只能測(cè)量它們的最終濃度，但這并不一定與它們的原始濃度成正比[18]。因此，出于生物監(jiān)測(cè)目的，qPCR 可以提供采樣環(huán)境中目標(biāo)物種的豐度信息。

隨著研究的發(fā)展，基于靶向PCR（targeted PCR）[19]或鳥(niǎo)槍測(cè)序[20]發(fā)展出更加通用的研究方法，可以鑒定出eDNA 中所有物種的存在，即定義為“宏基因組編碼”。DNA 宏基因組是指利用宏基因條形碼，對(duì)環(huán)境樣本中分離的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增和高通量測(cè)序，可對(duì)環(huán)境樣本中多個(gè)物種進(jìn)行鑒定[21]。Pompanon 等[22]2011 年用DNA 宏基因條形碼，在同一環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)了基于DNA 鑒定的許多分類(lèi)群。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)物種鑒定方法耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，可以高通量、快速地鑒定物種[23]。但其最大的局限性在于PCR 的偏向性，導(dǎo)致條形碼的分析準(zhǔn)確性及數(shù)據(jù)庫(kù)的完善度較低。要實(shí)現(xiàn)宏條形碼技術(shù)高通量、準(zhǔn)確、快速的物種鑒定，最為關(guān)鍵的是構(gòu)建完善的物種DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)、物種信息庫(kù)、信息共享和應(yīng)用平臺(tái)[24]。

3.2 研究步驟

3.2.1 DNA 條形碼選擇和設(shè)計(jì) 用PCR、qPCR方法進(jìn)行eDNA 研究時(shí)，都必須使用DNA 條形碼來(lái)分析。DNA 條形碼是用于樣本分類(lèi)鑒定的簡(jiǎn)短、標(biāo)準(zhǔn)化的遺傳標(biāo)記，其目的是優(yōu)化分類(lèi)鑒定，因此還必須選擇具有其他特性的標(biāo)記，比如用于基于eDNA 生物多樣性調(diào)查的DNA 條形碼。1 個(gè)理想的宏基因組碼應(yīng)該位于1 個(gè)基因組區(qū)域中。該區(qū)域在參考數(shù)據(jù)庫(kù)中針對(duì)所有目標(biāo)分類(lèi)單元進(jìn)行詳盡而準(zhǔn)確的記錄，以便獲得明確的分類(lèi)學(xué)標(biāo)識(shí)（如不遺漏種類(lèi)，無(wú)測(cè)序或匹配錯(cuò)誤）。在理想情況下，完美的DNA 條形編碼是1 個(gè)盡可能短的DNA 片段，顯示1 個(gè)高度可變的序列，兩側(cè)有2 個(gè)保守區(qū)域。Hebert 等[25]研究指出，核心保守區(qū)域?qū)δ繕?biāo)群體的所有物種都是有區(qū)別的，不與其他物種共享。這個(gè)定義包括種內(nèi)多態(tài)現(xiàn)象。相反，兩個(gè)側(cè)翼保守區(qū)在目標(biāo)類(lèi)群中是相同的，但是在非目標(biāo)類(lèi)群中不同。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域設(shè)計(jì)引物通常不好，因?yàn)橛捎谶z傳密碼較冗長(zhǎng)，通常每3 個(gè)核苷酸就會(huì)發(fā)生變異。事實(shí)上，DNA 條形碼已經(jīng)被證明在DNA 分類(lèi)中運(yùn)用較好，如動(dòng)物線(xiàn)粒體COI基因。此外，有研究[26]表明，對(duì)于某些目標(biāo)種群，引物中加入過(guò)多的堿基并不能很好地進(jìn)行引物退火擴(kuò)增。

3.2.2 樣品收集 一個(gè)合適的取樣方案對(duì)于任何eDNA 研究的成功都至關(guān)重要。但是，到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的抽樣方法。由于eDNA 由反映不同時(shí)間或不同生物體狀態(tài)的多種形式組成，在宏基因組條形編碼研究中，最優(yōu)的抽樣設(shè)計(jì)也可能會(huì)從同一樣本中提取到不同生物體。例如，細(xì)菌、真菌和樹(shù)木都可以作為同一編碼實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)，但微生物群落的組成在不同的空間上又明顯不同。因此，總體抽樣設(shè)計(jì)將是所有方面之間平衡的結(jié)果。設(shè)計(jì)取樣時(shí)，還要考慮方法的標(biāo)準(zhǔn)化和樣品降解的最小化。如果想得到合理優(yōu)化的樣本和盡可能均勻的DNA 信息，必須要考慮到PCR 檢測(cè)方法的抑制劑影響，以便優(yōu)化出相同的PCR 參數(shù)。eDNA 有多種形式，但可分為兩大類(lèi)：細(xì)胞內(nèi)DNA 和細(xì)胞外DNA。細(xì)胞內(nèi)DNA 存在于所有生物體中。當(dāng)存在于環(huán)境樣品中時(shí)，它可以來(lái)自單細(xì)胞生物，如細(xì)菌、古細(xì)菌，它們可以處于活動(dòng)狀態(tài)（細(xì)胞）或休眠階段（孢子）；也可能來(lái)自多細(xì)胞個(gè)體，如小型底棲動(dòng)物（如線(xiàn)蟲(chóng)、輪蟲(chóng)等）或較大生物體的分離片段；也可以存在于死細(xì)胞的殘骸中（如被其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)包圍或不被其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)包圍的細(xì)胞核和細(xì)胞器）。eDNA 也可以由游離的DNA 分子構(gòu)成，在水相中溶解，或吸附在不同類(lèi)型的有機(jī)或礦物顆粒表面。對(duì)于細(xì)菌，Costa 等[27]研究稱(chēng)，DNA 是通過(guò)特定的分泌系統(tǒng)釋放的；Thomas[28]研究稱(chēng)，DNA 可以通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性的某些非生物條件引起自然排泄。

3.2.3 DNA 抽提 許多商業(yè)試劑盒可用于從環(huán)境樣品中提取DNA。不同的DNA 提取方法對(duì)隨后獲得的種群分類(lèi)結(jié)果會(huì)有不同影響，包括是否存在分類(lèi)群以及目標(biāo)群的相對(duì)豐度。因此，只有在用相同的DNA 提取方法和相同的擴(kuò)增程序（即PCR條件和引物）來(lái)處理樣品時(shí)，才能對(duì)樣品進(jìn)行可靠的比較。Smets 等[29]指出，如果DNA 提取的樣本之間存在很大變化，則在DNA 提取前，最好向樣本添加內(nèi)部對(duì)照，以測(cè)試此步驟的效率。如果樣品是非均相的，根據(jù)提取方法的不同，就可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。在這種情況下，可以對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行多個(gè)平行樣本提取。Valiere 等[30]對(duì)于未經(jīng)過(guò)濾且新鮮取樣或保存在酒精中的水樣，高速離心，使沉淀的DNA 和細(xì)胞殘留物顆?；缓髼壣锨逡海詈笫褂蒙虡I(yè)試劑盒對(duì)顆粒進(jìn)行DNA 提取。然而，樣本中的eDNA 或微生物細(xì)胞含量通常不太高，無(wú)法在小樣本量下工作，相反通常需要進(jìn)行過(guò)濾濃縮后再提取DNA[31]。

3.2.4 DNA 擴(kuò)增、測(cè)序 對(duì)于微生物等特異性靶標(biāo)的研究，使用PCR 和qPCR 進(jìn)行特異性DNA條形碼擴(kuò)增和測(cè)序，可以得到靶標(biāo)基因。但是，eDNA 樣本往往會(huì)有不同物種，在進(jìn)行生物多樣性分析的時(shí)候，需要根據(jù)研究目的，選擇多個(gè)基因條形碼，如動(dòng)物研究可以選擇線(xiàn)粒體COI基因、12S rRNA 和18rDNA，植物研究可以選擇葉綠體DNA trnl 的保守P6 條形碼。Thomsen 等[32]通過(guò)擴(kuò)增環(huán)境水樣中混合DNA 的線(xiàn)粒體COI基因和Cytb基因，成功鑒別了該環(huán)境中包含的兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、甲蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)等。DNA 宏條形碼技術(shù)依賴(lài)于設(shè)計(jì)理想的引物，先從環(huán)境樣品中擴(kuò)增出高質(zhì)量的混合DNA 片段，再通過(guò)測(cè)序技術(shù)對(duì)復(fù)雜的DNA 片段進(jìn)行測(cè)序分析，最后得出研究目標(biāo)的DNA 編碼。1989 年，隨著第一臺(tái)PCR 儀的問(wèn)世，PCR 方法使該研究領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化，使得遺傳多態(tài)性分析比以往任何時(shí)候都要容易得多。第一代測(cè)序主要基于Sanger 方法[33]。為了實(shí)現(xiàn)這種方法，模板DNA 必須由克隆或PCR 產(chǎn)生的數(shù)百萬(wàn)個(gè)相同片段來(lái)表示，DNA 聚合酶從引物開(kāi)始延伸片段。第二代測(cè)序技術(shù)是基于大規(guī)模并行測(cè)序，包括羅氏454系統(tǒng)、pGM（IonTorrentTM）和Illumina 測(cè)序儀。市場(chǎng)上第一個(gè)可用的技術(shù)是454 系統(tǒng)，它使用焦磷酸測(cè)序。所有這些測(cè)序儀都需要在測(cè)序前擴(kuò)增單個(gè)片段。目前，最強(qiáng)大的第二代測(cè)序儀（NovaSeq 6000）可以產(chǎn)生比第一代測(cè)序器高出80 萬(wàn)倍的數(shù)據(jù)。第三代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)是能夠?qū)蝹€(gè)DNA 分子進(jìn)行測(cè)序，而無(wú)須任何事先擴(kuò)增。這一類(lèi)包含兩種測(cè)序儀：Sequel（依賴(lài)于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)）和MinION（基于納米孔方法）[34]。兩者都可以對(duì)相對(duì)較長(zhǎng)的DNA 片段進(jìn)行測(cè)序（通?？蛇_(dá)20 kb）。由于這兩種技術(shù)仍然具有較高的錯(cuò)誤率（高達(dá)10%），因此目前不適合分析eDNA。然而其特點(diǎn)是便攜性，如果誤差率可以接受，納米孔序列方法也可得到應(yīng)用，允許在該領(lǐng)域進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。

3.2.5 DNA 條形碼數(shù)據(jù)分析 隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，eDNA 的研究中最重要的部分就是處理大量的DNA 序列數(shù)據(jù)。除了所需的計(jì)算和存儲(chǔ)資源外，處理DNA 編碼數(shù)據(jù)的一個(gè)關(guān)鍵方面是它的噪音。先進(jìn)的樣品測(cè)序方法允許很好地測(cè)序種內(nèi)和種間生物多樣性，但也可以測(cè)序出所有隱蔽的分子產(chǎn)物。因此，數(shù)據(jù)分析主要的挑戰(zhàn)是過(guò)濾并減少數(shù)據(jù)的大小。測(cè)序產(chǎn)物可能含有非特異性擴(kuò)增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)，長(zhǎng)度過(guò)短的序列，以及PCR 過(guò)程中產(chǎn)生的一些嵌合體，需要對(duì)這些序列進(jìn)行修剪、去除，以得到供精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列。Boyer 等[35]介紹的OBITOLS 程序方法、Caporaso 等[36]介紹的QIME 等方法可實(shí)現(xiàn)DNA 宏條形碼分析，另外還有MOTHUR[37]、DADA2[38]、PipeCraft[39]等解決方案。在序列運(yùn)行中，序列質(zhì)量并不均勻，會(huì)出現(xiàn)一些序列讀取的平均質(zhì)量比其他序列差。對(duì)于全序列而言，在一次序列讀取中，從5'端到3'端序列質(zhì)量會(huì)逐漸降低。為了確保數(shù)據(jù)質(zhì)量，通常建議刪除低質(zhì)量的讀取，或者修剪3'端的讀取以刪除序列的低質(zhì)量部分[40]。Caporaso等[41]從正向和反向?qū)δ┒俗x取構(gòu)建完整的擴(kuò)增子序列后，根據(jù)擴(kuò)增片段一端或兩端添加的標(biāo)簽，將每個(gè)序列分配給其初始PCR。許多工具可執(zhí)行此任務(wù)，包括QIIME 和OBI 工具。OBI 更適合標(biāo)簽策略，標(biāo)簽直接連接到1 個(gè)或2 個(gè)引物的5'端，并且試驗(yàn)中使用的所有標(biāo)簽具有相同的長(zhǎng)度。每個(gè)理想的序列分類(lèi)單元（OTUs）應(yīng)該只包含來(lái)自1個(gè)物種序列，通過(guò)多個(gè)對(duì)條形碼的分析可以獲得該環(huán)境中各種物種的存在情況。

4 用途、問(wèn)題和前景

4.1 用途

當(dāng)通過(guò)傳統(tǒng)方法很難獲得完整的生物多樣性數(shù)據(jù)時(shí)，eDNA 已被用于獲取生物多樣性研究。eDNA 檢測(cè)方法的敏感性使其非常適合于檢測(cè)瀕危、低密度入侵、瞬時(shí)和隱秘物種的存在，特別是當(dāng)檢測(cè)低密度物種的采樣工作難以控制時(shí)，其敏感性、簡(jiǎn)單性和減少危害的優(yōu)勢(shì)愈加顯現(xiàn)出來(lái)。eDNA 檢測(cè)方法已被作為一種生物多樣性監(jiān)測(cè)工具應(yīng)用于各種生物群落，經(jīng)常與傳統(tǒng)方法相結(jié)合。除了生物多樣性監(jiān)測(cè)外，eDNA 還可能用于群體遺傳學(xué)研究，從而緩解入侵采樣的一些問(wèn)題。群體遺傳eDNA 是一個(gè)新興的領(lǐng)域，它提供了eDNA 更為廣闊的研究前景。

4.1.1 外來(lái)物種入侵檢測(cè) 國(guó)外基于eDNA 的單一物種檢測(cè)在生物入侵、受威脅的動(dòng)物物種方面已經(jīng)相當(dāng)成功，在水生環(huán)境中基于eDNA 的英國(guó)瀕危蠑螈的檢測(cè)率比傳統(tǒng)方法高出許多，并且不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性[42]。該技術(shù)的高靈敏度和可遠(yuǎn)程檢測(cè)應(yīng)該是eDNA 方法更具吸引力的主要原因。在物種入侵的情況下，針對(duì)特定物種的eDNA 分析特別有吸引力，因?yàn)樗鼈兗瓤梢詸z測(cè)低密度種群（例如在入侵的早期階段），還可以檢測(cè)任何生命階段，甚至是那些形態(tài)鑒定不可靠或耗時(shí)的階段（例如幼蟲(chóng)）[43]。

4.1.2 物種檢測(cè) Piaggio 等[44]在佛羅里達(dá)州通過(guò)對(duì)eDNA 進(jìn)行物種特異性PCR 鑒定，在5 個(gè)野外取樣地點(diǎn)檢測(cè)到緬甸蟒。Ishige 等[45]在森林中對(duì)包括亞洲象在內(nèi)的6 種瀕危物種進(jìn)行物種檢測(cè)。孫晶瑩[46]使用eDNA 宏基因編碼技術(shù)進(jìn)行枝角類(lèi)浮游動(dòng)物物種鑒定及其生物量監(jiān)測(cè)研究，以太湖流域常見(jiàn)的5 種浮游動(dòng)物，擬同形溞、大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞為研究對(duì)象，建立了一種基于eDNA 宏條形碼技術(shù)的物種定量方法。

4.1.3 生物量估算 水環(huán)境中生物量估算的研究已經(jīng)非常多，涉及淡水生態(tài)系統(tǒng)、海洋環(huán)境等領(lǐng)域。根據(jù)已發(fā)表的研究，似乎魚(yú)類(lèi)、兩棲動(dòng)物和軟體動(dòng)物將相對(duì)大量的eDNA 釋放到環(huán)境中[47]。但是，節(jié)肢動(dòng)物的eDNA 較難檢測(cè)，可能是因?yàn)樗鼈兊耐夤趋罍p少了表皮細(xì)胞的脫落，如Tréguier[48]在低豐度條件下檢測(cè)小龍蝦eDNA 時(shí)遇到了困難。另外，除了淡水生態(tài)系統(tǒng)中動(dòng)物的eDNA 外，一些外來(lái)的eDNA 也可以被整合到系統(tǒng)中，導(dǎo)致在關(guān)注群落生物量時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性。例如，來(lái)自家畜或野生動(dòng)物的糞便，或排放的污水。Evans[49]研究指出，對(duì)于特定的魚(yú)類(lèi)或兩棲類(lèi)，用qPCR 方法可以監(jiān)測(cè)到水中釋放的eDNA 濃度與該物種的生物量有關(guān)。因此，eDNA 數(shù)量和物種豐富度之間的關(guān)系應(yīng)該能夠?qū)DNA 的監(jiān)測(cè)方法納入漁業(yè)管理計(jì)劃。李苗等[50]2018 年對(duì)于eDNA 在水體中存留時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)合qPCR 定量分析了水環(huán)境中eDNA 隨時(shí)間的降解情況，選擇了最適于eDNA 隨時(shí)間降解的統(tǒng)計(jì)模型。同時(shí)，李苗等[51]2019 年建立了中國(guó)對(duì)蝦生物量評(píng)估的eDNA 檢測(cè)技術(shù)，以中國(guó)對(duì)蝦為研究對(duì)象，采用濾膜法富集eDNA，建立了中國(guó)對(duì)蝦eDNA 生物量估算方法，提高了中國(guó)對(duì)蝦的檢出率，為后續(xù)中國(guó)對(duì)蝦的分布監(jiān)測(cè)及生物量評(píng)估提供了基礎(chǔ)。

4.1.4 水中生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測(cè) 來(lái)自地表水eDNA的第一份報(bào)告是通過(guò)使用特定引物擴(kuò)增線(xiàn)粒體DNA 來(lái)檢測(cè)人類(lèi)、牛、羊和豬的潛在糞便污染的試驗(yàn)[52]。Ficetola[53]對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)的深入研究表明，利用池塘中的eDNA 可以檢測(cè)青蛙物種。近年來(lái)，海洋微生物多樣性、大型生物監(jiān)測(cè)等研究發(fā)展也越來(lái)越迅速，盡管基于eDNA 的海洋大型生物研究長(zhǎng)期落后于微生物學(xué)，但其為保護(hù)生物學(xué)和生物監(jiān)測(cè)應(yīng)用帶來(lái)了巨大希望。Sigsgaard[54]2016年開(kāi)始用eDNA 監(jiān)測(cè)魚(yú)類(lèi)種群。在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)2 個(gè)線(xiàn)粒體DNA 多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，以確定鯨鯊種群的遺傳多樣性和數(shù)量。為了正確估計(jì)種群特征，對(duì)水樣中的誤差率和eDNA 衰減進(jìn)行評(píng)估。利用這些線(xiàn)粒體區(qū)域的qPCR 和鯨鯊最可能的獵物（鯖魚(yú)、金槍魚(yú)的魚(yú)卵）的標(biāo)記，即使在野外沒(méi)有觀察到鯨鯊，也能夠確定捕食者和獵物的eDNA 數(shù)量之間的正相關(guān)關(guān)系，揭示了eDNA 在群體遺傳學(xué)和營(yíng)養(yǎng)相互作用研究中的意義。

4.2 問(wèn)題和前景

eDNA 的一個(gè)主要不穩(wěn)定特征是從環(huán)境樣品中獲得的提取物的非均質(zhì)性，因此使用eDNA 通常不像使用從已知植物或動(dòng)物物種的組織樣本中提取的DNA 那樣簡(jiǎn)單，會(huì)遇到很多情況涉及從沒(méi)有酶抑制劑的高質(zhì)量濃縮DNA（與從組織中提取的DNA 相當(dāng)），到高度稀釋和降解的DNA（與古代DNA 研究中提取的DNA 類(lèi)似）等等情況[55]。此外，已經(jīng)證明不同的DNA 提取方法在去除PCR抑制劑方面的效率并不相同，取決于樣品類(lèi)型（例如土壤樣品中的腐殖成分含量），這可能導(dǎo)致不同的結(jié)果[56]。目前，還沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)單而標(biāo)準(zhǔn)的方案適合于所有類(lèi)型的eDNA 分析。

目前，對(duì)eDNA 動(dòng)力學(xué)的理解在空間和時(shí)間上仍有很大的局限性。Seymour[57]等開(kāi)展了一項(xiàng)計(jì)劃，主要目標(biāo)是了解eDNA 在水（如河流）環(huán)境中的生態(tài)相關(guān)性，對(duì)北威爾士康威河流域水生物群落eDNA 的時(shí)間、空間和環(huán)境動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)估，試驗(yàn)結(jié)果為eDNA 的降解和遷移動(dòng)力學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

同時(shí)，DNA 宏基因組編碼還面臨著幾個(gè)重要的技術(shù)難題，主要涉及引物偏差和PCR 錯(cuò)誤，更普遍的是需要在所有水平上進(jìn)行試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，以便進(jìn)行交叉試驗(yàn)比較。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)研究的問(wèn)題和系統(tǒng)隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整，因此宏基因編碼試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化較難實(shí)現(xiàn)。此外，標(biāo)準(zhǔn)化有阻礙或減緩進(jìn)一步發(fā)展的內(nèi)在風(fēng)險(xiǎn)。比如Sanger 測(cè)序時(shí)發(fā)展起來(lái)的DNA 條形碼，在第二代測(cè)序時(shí)遇到了測(cè)序和數(shù)據(jù)分析困難。

目前，國(guó)內(nèi)研究者已經(jīng)使用eDNA 對(duì)于生物量、物種生物多樣性等方面開(kāi)展了部分研究，但是研究還不多，系統(tǒng)化也還不成熟，研究對(duì)象多集中于水生動(dòng)物的生物量研究，對(duì)于土壤、植物等方面研究較少，說(shuō)明eDNA 的研究前景依然廣闊。