全國細菌耐藥監(jiān)測學術(shù)委員會

為了保證全國細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果的準確性，不斷提高監(jiān)測工作質(zhì)量，遏制細菌耐藥性增長，特對影響細菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果準確性的因素提出規(guī)范性要求，包括檢驗前、中、后全過程，人員、設(shè)備、設(shè)施、環(huán)境、方法學等各方面。

1 人員

微生物實驗室負責人應滿足以下要求：①具有醫(yī)學及其相關(guān)專業(yè)或生物學本科及以上學歷，從事微生物檢驗工作至少3年，或具有醫(yī)學及其相關(guān)專業(yè)?？茖W歷，從事微生物檢驗工作至少5年；②具有中級或以上專業(yè)技術(shù)職稱；③具備細菌學檢驗質(zhì)量控制、生物安全相關(guān)知識；④具有培訓、溝通、管理等能力。

負責細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)上報人員應從事細菌檢驗工作至少1年，能夠正確使用全國細菌耐藥監(jiān)測信息系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)上報工作，并應用統(tǒng)計軟件對本院細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分層分析。

從事細菌檢驗的新員工或離崗半年及以上員工經(jīng)評估合格后方可獨立操作。

從事細菌檢驗人員應相對固定（至少固定2人），數(shù)量滿足工作需要，每年需參加專業(yè)學習，包括自行組織學習、線上學習、外出學習等形式。

2 設(shè)施與環(huán)境

設(shè)施和環(huán)境應與檢測內(nèi)容相適應。

2.1 布局

微生物實驗室若為獨立單元，應劃分為實驗區(qū)和非實驗區(qū)。實驗區(qū)應具有安全運行、清潔、維護所需空間，有足夠的空間擺放隨時使用的物品；非實驗區(qū)應有存放私人物品的設(shè)施、工作人員用餐和休息的場所。微生物實驗室若為臨床實驗室的一部分而非獨立單元，可與其他實驗室共享非實驗區(qū)。

2.2 設(shè)施

2.2.1 溫度、濕度、通風 應依據(jù)所用分析設(shè)備和實驗過程的要求，制定環(huán)境溫度、濕度控制要求并記錄。應有溫度、濕度失控時的處理措施并記錄。

2.2.2 照明 避免陽光直射。燈光能夠分區(qū)控制，以便根據(jù)需要調(diào)節(jié)光線。

2.2.3 水槽 安裝足夠的水槽供染色、廢液處理和洗手等使用。洗手水槽應獨立設(shè)置，不可與處理標本的水槽混用。水龍頭應為非手觸式，備洗手液。實驗室出口附近應安裝洗手水槽，以供工作人員離開時洗手。

2.2.4 工作臺 工作臺面大小、高度適宜，材料應光滑、致密、耐用，易清潔、消毒，抗污染。放置重型設(shè)備的工作臺足夠牢固，減少震動。

2.2.5 其他 應配備個人防護裝備，如護目鏡、防護服、手套、口罩、帽子，以及必要的消防、防盜等安全設(shè)施。實驗室應配置不間斷電源（UPS）和/或雙路電源以保證關(guān)鍵設(shè)備（如需要控制溫度和連續(xù)監(jiān)測的分析儀、培養(yǎng)箱、冰箱等）的正常工作。宜配備含乙醇速干手消毒劑。

2.3 生物安全

微生物實驗室是對病原菌進行分離、培養(yǎng)、鑒定等臨床檢測工作的特殊場所，其設(shè)計和管理應在風險評估的基礎(chǔ)上，確定實驗室生物安全水平，確保工作人員在安全的條件下開展工作，遵循安全、舒適、高效的原則，須滿足以下基本要求：①至少符合生物安全2 級（BSL2）標準；②盡可能減少病原菌對實驗室內(nèi)部以及外部環(huán)境的污染；③有足夠空間放置儀器設(shè)備，工作人員能夠安全地從事檢驗工作和質(zhì)量控制活動。

國家衛(wèi)生健康委員會（原衛(wèi)生部）制定的《人間傳染的病原微生物名錄》明確規(guī)定了各種病原體操作的防護要求，檢驗過程中發(fā)現(xiàn)高致病性病原體時，應按相關(guān)法規(guī)的要求處理。

由于實驗室可能接觸高于預期風險的標本，故具有潛在生物危害的標本應在生物安全柜中開蓋、處理。信息有限標本的風險評估可參考醫(yī)學、流行病學資料，如發(fā)病率、病死率、可疑傳播途徑、暴發(fā)調(diào)查資料、標本來源地信息。

3 設(shè)備和試劑

實驗室設(shè)備的種類和數(shù)量應能滿足臨床需要，至少包括：生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、普通培養(yǎng)箱（包括溫度可調(diào)培養(yǎng)箱）、冰箱、光學顯微鏡、細胞離心機、組織碾磨器具、游標卡尺（適用時），以及與細菌分離、培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感性試驗相適應的試劑（含培養(yǎng)基、質(zhì)控菌株等）。

3.1 設(shè)備校準和計量學溯源

新設(shè)備經(jīng)性能驗證，且滿足要求方可用于患者標本檢測。

應遵循國家、行業(yè)要求制定設(shè)備和試劑校準、檢定周期，并保存記錄。鑒定儀、藥敏儀、血培養(yǎng)儀的校準應滿足制造商的要求，其他建議如下：①每12個月進行檢定或校準的設(shè)備宜包括生物安全柜（高效過濾器、氣流、負壓等參數(shù)）、CO2培養(yǎng)箱（CO2濃度顯示計、溫度顯示器或溫度計）、細胞離心機、壓力滅菌器、游標卡尺、普通培養(yǎng)箱（溫度顯示器或溫度計）、溫度計、移液器、微量滴定管或自動分配器。②每6 個月進行檢定或校準的設(shè)備應包括濁度儀。③保存儀器功能監(jiān)測記錄的設(shè)備宜包括溫度依賴設(shè)施（冰箱、培養(yǎng)箱、水浴箱、加熱塊等每日記錄溫度）、CO2培養(yǎng)箱（每日記錄CO2濃度和溫度）、超凈工作臺（定期做無菌試驗）、壓力滅菌器（至少每個滅菌包外貼化學指示膠帶、內(nèi)置化學指示卡，定期進行生物監(jiān)測）。

3.2 設(shè)備維護與維修

制定預防性維護計劃并記錄的設(shè)備至少應包括：生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、鑒定儀、血培養(yǎng)儀、壓力滅菌器、超凈工作臺、顯微鏡和離心機。

如果設(shè)備故障影響了方法學性能，如自動化藥敏儀器的光學系統(tǒng)故障，在設(shè)備修復、校準后，實驗室應通過檢測質(zhì)控菌株或已知結(jié)果標本的方式進行性能驗證。

3.3 試劑和耗材驗收

試劑和耗材驗收試驗應符合如下要求：①新批號及每一貨次試劑和耗材使用前，通過新舊批號平行實驗或常規(guī)質(zhì)控等方法進行驗證，并記錄。②新批號及每一貨次試劑和耗材，如吲哚試劑，桿菌肽，奧普托辛，Ⅹ、Ⅴ、ⅩⅤ 因子紙片等使用陰性和陽性質(zhì)控菌進行驗證。③新批號及每一貨次的藥敏試驗紙片使用前以標準菌株進行驗證。④新批號及每一貨次的染色劑（如革蘭染色）使用已知陽性和陰性（適用時）的質(zhì)控菌株進行驗證。⑤新批號及每一貨次直接抗原檢測試劑（無論是否含內(nèi)質(zhì)控）使用陰性和陽性外質(zhì)控進行驗證。⑥培養(yǎng)基外觀良好（平滑、水分適宜、無污染、適當?shù)念伾秃穸?，試管培養(yǎng)基濕度適宜），新批號及每一貨次的商品或自配培養(yǎng)基應檢測相應的性能，包括無菌試驗、生長試驗或與舊批號平行試驗、生長抑制試驗（適用時）、生化反應（適用時）等，應以質(zhì)控菌株進行驗證。⑦一次性定量接種環(huán)每批次抽樣驗證。

3.4 自配試劑和耗材記錄

自配試劑或培養(yǎng)基，應記錄制備過程，內(nèi)容至少包括：①培養(yǎng)基（試劑）名稱和類型；②配制日期和配制人員；③培養(yǎng)基（試劑）的體積；④分裝體積；⑤成分及其含量、制造商、批號；⑥最初和最終pH值（適用時）；⑦無菌措施，包括實施的方式、時間和溫度（適用時）；⑧儲存條件及時間。

4 檢驗前過程

4.1 標本采集手冊

實驗室應遵循行業(yè)標準或指南編寫、定期審核標本采集和運送標準化操作程序供醫(yī)務人員查閱并遵照執(zhí)行（相關(guān)技術(shù)資料可參考有關(guān)文獻）。

“標本采集手冊”除符合通用要求外，還應明確規(guī)定以下內(nèi)容：①不同部位標本的采集方法，如明確說明并執(zhí)行血培養(yǎng)標本采集的消毒技術(shù)、采血量。診斷成人不明原因發(fā)熱、血流感染時應在24 h內(nèi)不同部位至少采集2套，每套2瓶（需氧、厭氧各一瓶）；②合格的標本類型、送檢次數(shù)、標本量；③明確規(guī)定需要盡快運送的標本；④合適的運送培養(yǎng)基；⑤延遲運送標本的保存方法及期限；⑥安全運送方法（如密封容器、無標本外漏等）。

4.2 申請單信息

除一般要求外，應標明標本來源和種類，必要時說明感染類型和/或目標微生物、抗菌藥物使用信息。

4.3 標本采集和運送

應遵循實驗室制定的“標本采集手冊”采集和運送標本。醫(yī)務人員應記錄標本采集時間，并盡可能記錄患者自采標本的采集時間。

4.4 標本接收

實驗室接收的所有標本均應進行紙質(zhì)或電子登記，記錄接收時間，拒收以下標本：①容器不適合或泄漏，如培養(yǎng)標本未置無菌容器或標本滲漏；②標本錯誤或不恰當，如培養(yǎng)標本含甲醛等固定液、Foley導尿管頭培養(yǎng)、拭子干涸；③送檢時間延遲或轉(zhuǎn)送溫度不適合。

5 檢驗過程

實驗室應遵循行業(yè)標準或指南制定合格標本（或不合格標本）標準、各種標本處理的標準化操作程序、標本保留期限（用于核對或必要的補充試驗），宜建立緊急檢查程序，明確需要緊急處理的標本類型、檢驗項目，并遵照執(zhí)行（相關(guān)技術(shù)資料可參閱有關(guān)文獻）。

5.1 細菌培養(yǎng)和鑒定

所選擇的涂片、染色技術(shù)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境應能識別、分離相應病原菌；鑒定方法應符合相關(guān)要求，如：通過革蘭染色、菌落形態(tài)、生長條件、代謝反應、生化和酶活性、血清學、抗菌藥物耐藥譜等特性鑒定。

組織標本應碾磨后檢驗；痰培養(yǎng)應先染色鏡檢評估標本合格性，至少接種血平板和巧克力平板；尿液常規(guī)進行定量培養(yǎng)（菌落計數(shù)），能分離、鑒定革蘭陽性和/或革蘭陰性細菌；腦脊液培養(yǎng)標本立即處理，常規(guī)進行離心、革蘭染色，至少接種血平板和巧克力平板，能分離常見苛養(yǎng)菌；陽性血培養(yǎng)瓶，根據(jù)直接涂片結(jié)果轉(zhuǎn)種相應的培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境。血平板和巧克力平板，均應置CO2環(huán)境培養(yǎng)。

當流行病學或感染控制需要時，實驗室應進行相應檢測或?qū)⒕晁陀袟l件的實驗室進行檢測。建議有條件的實驗室建立相關(guān)檢測技術(shù)，以滿足流行病學或感染控制需要。

5.2 抗菌藥物敏感性試驗

應遵循“全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案”、行業(yè)標準、制造商建議，盡量包括本醫(yī)院臨床常用抗菌藥物，制定常規(guī)藥敏試驗方法的標準化操作程序，包括藥敏試驗操作步驟、各類病原體和/或標本的檢測藥物、質(zhì)控方法和標準、結(jié)果報告和解釋，特殊耐藥性檢測方法，少見藥敏試驗結(jié)果的處理步驟等。

抗菌藥物敏感性試驗方法包括紙片擴散法、稀釋法（瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法）、濃度梯度擴散法（E試驗）或自動化儀器檢測。實驗室應提供與服務相適應，且滿足“全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案”的抗菌藥物敏感性試驗。

應在技術(shù)方案、行業(yè)標準、制造商文件更新6個月內(nèi)完成抗菌藥物敏感性試驗方法標準化操作程序的修訂并實施。

除常規(guī)藥敏試驗方法外，宜利用經(jīng)評估的分子技術(shù)快速檢測、鑒定臨床分離菌株或標本（含血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)基）中的病原體，以及細菌的耐藥性。

6 檢驗后過程

6.1 結(jié)果報告

盡快報告結(jié)果，為診斷、治療、預防提供信息。宜開展分級報告，如無菌體液、組織標本涂片或濕片鏡檢結(jié)果、快速鑒定結(jié)果、藥敏試驗結(jié)果等。

出現(xiàn)對患者處理具有重要意義的結(jié)果時，應立即通知臨床醫(yī)師或相關(guān)人員。如血培養(yǎng)陽性結(jié)果、腦脊液顯微鏡檢查及培養(yǎng)陽性結(jié)果、法定傳染病等。

應報告具有臨床意義的結(jié)果。結(jié)果報告應與檢驗內(nèi)容一致，如糞便沙門菌、志賀菌培養(yǎng)，報告為“未檢出沙門菌、志賀菌”。

藥敏報告應注意標本類型、細菌種類等，如糞便分離的傷寒沙門菌只報告氨芐西林、一種氟喹諾酮類藥物和甲氧芐啶-磺胺甲唑。藥敏報告單除一般信息外，應至少包括細菌名稱、藥物名稱、折點、MIC值或抑菌圈直徑、結(jié)果解釋，不報告替代藥物的藥敏試驗結(jié)果。

疑似醫(yī)院感染暴發(fā)時，應立即報告醫(yī)院感染控制相關(guān)人員。

6.2 菌種保存

實驗室應遵照國家法令法規(guī)，如中華人民共和國國務院發(fā)布的《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等，制定菌種保存規(guī)定，嚴格管理菌種，保證有效、安全使用。

實驗室應保存質(zhì)控菌株，包括標準菌株、經(jīng)證實的其他來源菌株。

菌種應有專人保管，詳細記錄名稱、編號、來源、保存日期、傳代等，不得擅自處理或帶出實驗室，如確需帶離實驗室，應做詳細記錄。

6.3 檢驗后標本的處置

檢驗后標本、污染培養(yǎng)基等感染性廢棄物應在實驗區(qū)域內(nèi)消毒或去污染。如果在處理前運送，也應置防穿刺、防滲漏容器，并適當標記和記 錄。

6.4 耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)統(tǒng)計

至少每年進行一次本機構(gòu)耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并將結(jié)果發(fā)布給臨床及相關(guān)人員，發(fā)現(xiàn)新的流行趨勢時，應立即報告相關(guān)人員。

7 質(zhì)量控制及質(zhì)量改進

7.1 標本

全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)網(wǎng)點醫(yī)院應根據(jù)本院實際開展標本質(zhì)量控制和改進工作。每年至少制定一種標本質(zhì)量改進目標，并定期向相關(guān)部門（醫(yī)務處、護理部和/或臨床科室等）反饋、評估。

實驗室應制定合格痰培養(yǎng)標本標準、不合格痰標本處理方法，并遵照執(zhí)行。提倡實驗室對有意義的培養(yǎng)標本實施直接顯微鏡檢查及分級報 告。

7.2 抗菌藥物敏感性試驗

實驗室引進抗菌藥物敏感性試驗新方法時，應以標準菌株連續(xù)檢測20～30 d，每組藥物/細菌超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC值）的頻率應不超過（≤）1/20或3/30；也可采用替代質(zhì)控方案，即連續(xù)5 d，每天對每組藥物/細菌重復測定3次，每次單獨制備接種物，15個數(shù)據(jù)超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC值）的結(jié)果應不超過（≤）1個，若失控結(jié)果為2～3個，則如前述，再進行5 d，每天3次重復試驗，30個數(shù)據(jù)失控結(jié)果應不超過（≤）3個。此后，應每周使用標準菌株進行質(zhì)控。若檢測頻率低于每周1次，則每個檢測日應進行質(zhì)控。采用自動或半自動儀器檢測MIC時，應按照制造商的要求進行質(zhì)控。

7.3 使用中試劑

實驗室應制定使用中試劑質(zhì)量控制周期和方法，滿足以下要求：①使用中的染色劑，宜每周（如革蘭染色，若檢測頻率低于每周1次，則實驗當日）、當日（如抗酸染色）或每次（如抗酸桿菌熒光染色）用已知陽性和陰性（適用時）質(zhì)控菌株檢測。②凝固酶、過氧化氫酶、氧化酶、β內(nèi)酰胺酶，實驗當日應做陰性和陽性質(zhì)控，商業(yè)頭孢菌素試劑的β內(nèi)酰胺酶試驗應遵循制造商的建議。診斷性抗血清試劑，實驗當日至少應做多價血清陰性和陽性質(zhì)控。定性試驗試劑每次檢測時應至少包括陽性和陰性質(zhì)控菌株。不含內(nèi)質(zhì)控的直接抗原檢測試劑，實驗當日應檢測陽性和陰性質(zhì)控。

7.4 質(zhì)控品

應貯存與診斷相配套的質(zhì)控物，以便在染色、試劑（包括培養(yǎng)基）、試驗、鑒定系統(tǒng)和抗菌藥物敏感性試驗中使用。最理想的質(zhì)控菌是標準菌株，但實驗室難以獲得與其檢測能力相應的所有標準菌株，可依次選擇標準菌株、能力驗證或室間質(zhì)評菌株，以及其他來源的已知菌株用于質(zhì)量控制。

藥敏試驗應選用標準菌株。藥敏試驗質(zhì)控所用標準菌株和藥物的種類和數(shù)量應覆蓋向臨床報告藥敏試驗結(jié)果的菌種和藥物種類。實驗室應保存標準菌株的來源、傳代等記錄，并有證據(jù)表明標準菌株性能滿足要求，至少貯存以下標準菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（紙片法）、金黃色葡萄球菌ATCC 29213（稀釋法）、肺炎鏈球菌ATCC 49619、糞腸球菌ATCC 29212（稀釋法）、流感嗜血桿菌ATCC 49247或ATCC 49766（取決于所測試藥物）。

7.5 檢驗結(jié)果一致性

實驗室應制定人員比對程序，規(guī)定由多名專業(yè)人員實施的手工檢驗項目的驗證方法和判斷標準，定期進行工作人員的能力比對，至少包括顯微鏡檢查、培養(yǎng)結(jié)果判讀、抑菌圈測量、結(jié)果報 告。

7.6 檢驗結(jié)果準確性

應有證據(jù)表明臨床檢驗及細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果的準確性，內(nèi)容至少包括細菌分離（包括苛養(yǎng)菌）、鑒定、藥敏試驗。通常以參加能力驗證或室間質(zhì)量評價活動且獲得合格結(jié)果來證明。實驗室應保留參加能力驗證/室間質(zhì)評活動的原始記錄、結(jié)果和證書。

檢驗結(jié)果準確性評價應由從事常規(guī)工作的人員使用與患者標本相同的檢驗方法進行。禁止與其他實驗室核對檢測結(jié)果。對“不滿意”和“不合格”的評價結(jié)果需進行分析，采取糾正措施并記錄。