王 昭 王華夏 劉 源 吳文慧

華北理工大學口腔醫(yī)學院 河北唐山 063210

金屬醫(yī)用材料的使用已經(jīng)有很長的歷史了，早在公元前300年的腓尼基人就開始使用金屬絲去修復牙齒，唐朝時期，就已經(jīng)開始使用銀、銅等去修補缺失的牙體，之后隨著人們發(fā)現(xiàn)的金屬材料越來越多，鈷鉻合金、不銹鋼、鈦以及合金相繼開發(fā)成功，鈷鉻合金醫(yī)用材料也相繼在牙科和骨科等廣泛應(yīng)用。在口腔局部環(huán)境和慢性刺激如長期使用口腔醫(yī)用鈷鉻合金基托材料的義齒、正牙器等時，其表面容易寄生白色念珠菌，引發(fā)口腔念珠菌疾病[1，2]。銀離子作為一種抗菌材料鑲嵌在基托材料上時可以對微生物產(chǎn)生作用，影響微生物的生長、繁殖從而導致微生物喪失生物活性。在實驗中通過調(diào)節(jié)鍍銀的銀離子濃度，使銀離子和鈷鉻合金基托材料能夠長期結(jié)合并且對白色念珠菌有較好抑制作用，為口腔基托材料鍍銀抑制口腔白色念珠菌的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備 鈷鉻合金試件、實驗試劑均來自華北理工大學材料與工程學院，白色念珠菌、馬鈴薯培養(yǎng)基及沙氏培養(yǎng)基均來自上海研生事業(yè)有限公司。主要實驗儀器：X射線衍射儀(日本理學株式會社)；掃描電子顯微鏡(日本日立儀器公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；恒溫培養(yǎng)箱(卓越醫(yī)療器械廠)。

1.2試件制備 鈷鉻合金清洗、粗化、敏化、活化、化學鍍銀反應(yīng)后，再通過后期的打磨處理，通過性能檢測如質(zhì)量檢測、厚度檢測、粗糙度檢測等，得到標準試件12個，直徑為5mm，厚度為1mm。

1.3SEM掃描電鏡分析 對在最佳實驗條件下獲得的銀層進行SEM電鏡掃描，圖1為放大5000倍電鏡掃描結(jié)果，圖2為放大10000倍電鏡掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在此條件下形成的銀層內(nèi)晶體的顆粒呈球狀并且尺寸較均勻，銀顆粒堆積結(jié)構(gòu)致密，鍍層脫落較少，表面均勻，結(jié)合牢固并且與鈷鉻合金材料間未見明顯的間隙。

1.4抑菌實驗

1.4.1馬鈴薯液體培養(yǎng)基的制作 將馬鈴薯培養(yǎng)基26.1 克加入無菌水至1000 mL并使其溶解后，將其倒入廣口瓶中。隨后將廣口瓶放在高壓蒸汽滅菌箱中121°滅菌15～20分鐘，待廣口瓶中液體達到室溫后，取出放入冰箱中備用，不要打開廣口瓶蓋防止雜菌污染。

1.4.2沙氏固體培養(yǎng)基的制作 用電子秤稱取沙氏瓊脂培養(yǎng)基14.5 克加入無菌水至220 mL并使其溶解，將其倒入廣口瓶中。將廣口瓶放在高壓蒸汽滅菌箱中121°高溫1小時，冷卻至55°左右。與此同時打開無菌工作臺進行殺菌30分鐘，再將冷卻好的液體培養(yǎng)基在無菌工作臺上嚴格按照無菌操作將培養(yǎng)基倒入高壓滅菌的無菌培養(yǎng)皿，在無菌工作臺上水平放置培養(yǎng)皿至溫度達到室溫固化，將培養(yǎng)皿倒置密閉后放在冰箱里保存。

圖1 放大5000倍電鏡掃描結(jié)果

圖2 放大10000倍電鏡掃描結(jié)果

1.4.3白色念珠菌復蘇 將冷凍在零下保存的白色念珠菌和高溫滅菌后的西林瓶放至室溫，超凈工作臺殺菌30分鐘后，在超凈工作臺上點燃酒精燈，在酒精燈旁進行操作，用大號移液槍將馬鈴薯培養(yǎng)液注入西林瓶中，將細菌放入西林瓶中震蕩2～3分鐘，使其充分擴散后，用移液槍將菌液均勻的涂在培養(yǎng)基上，在37°恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

1.4.4抗菌測試 將復蘇后的白色念珠菌移至常溫下的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中制成細菌懸浮液，用移液器將細菌懸浮液滴到沙氏培養(yǎng)基上，用無菌涂布器均勻涂布，用75%的乙醇將試樣消毒放在沙氏培養(yǎng)基上，使試樣和培養(yǎng)基有效接觸，將培養(yǎng)皿放置在35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時，重復數(shù)次實驗選出最佳實驗結(jié)果，拍照并測量抑菌環(huán)寬度，分析試件的抑菌性。

1.5統(tǒng)計學分析 采用配對設(shè)計的t檢驗，檢驗三組實驗試件與空白試件的對比，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用方差分析檢驗三組實驗試件對白色念珠菌的抑菌性，以F≥1表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1抑菌環(huán)觀察 在抗菌實驗24小時后對抗菌結(jié)果進行觀察記錄，如圖3～圖7。

2.2結(jié)果分析 三個實驗組與未鍍銀空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)方差分析，三個實驗組對白色念珠菌的抑菌性存在差異(F=4.973，P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度鍍銀鈷鉻合金的抑菌環(huán)比較

圖3 復蘇后的菌群

圖4 5g/L硝酸銀試件抑菌結(jié)果

圖5 2g/L硝酸銀試件抑菌結(jié)果

圖6 3g/L硝酸銀試件抑菌結(jié)果

圖7 未處理的試件抑菌結(jié)果

3 討論

長期在口腔中使用的醫(yī)用鈷鉻合金基托材料，其表面容易寄生白色念珠菌，白色念珠菌對口腔黏膜上皮有較強的粘附性，引發(fā)一系列口腔疾病[3]。為了降低材料表面的細菌附著，預防由于白色念珠菌引起的口腔疾病，臨床上廣泛使用機械清理、化學藥物浸泡等方法，然而這些方法都存在損傷鈷鉻合金材料表面、降低材料使用壽命、增強細菌抗藥性等缺點。近年來，為了滿足市場的需要，人們著手研究銀離子在鈷鉻合金材料鍍銀時可以對白色念珠菌產(chǎn)生的抑制作用，從而直接殺滅附著的細菌，減少不必要材料機械刷洗，降低細菌抗藥性的發(fā)生并且更好的預防口腔疾病[4]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，銀離子作用的主要機制有以下幾點：銀離子會干擾微生物細胞壁的合成，使微生物喪失與外界環(huán)境的滲透平衡，使之失去滲透壓的保護作用而致死；銀離子可以導致微生物細胞膜的損傷，使其死亡；銀離子還具有抑制微生物蛋白質(zhì)的合成、干擾微生物核酸的形成等。銀離子相比其它具有抗菌性能的無機金屬離子具有更高的抗菌性能。載銀鈷鉻合金基托材料是將含有銀離子的無機鹽在特定條件下鍍到晶體結(jié)構(gòu)中而產(chǎn)生抗菌性能的材料，其抗菌譜廣，不易溶解，對主要造成口腔疾病的白色念珠菌具有較強的抗菌作用[5]。

此外，人體口腔中腺體分泌唾液，起到了濕潤、抗菌以及保護的作用，然而唾液蛋白或糖蛋白可吸附至牙體、各種修復材料以及義齒上形成生物膜，不久后便有白色念珠菌在其表面附著形成白色念珠菌生物膜。銀試劑在加入白色念珠菌培養(yǎng)基后能夠改變白色念珠菌初步粘附狀況和生物膜形成狀況，隨銀離子濃度上升，白色念珠菌生物膜的活性降低，生物膜的生物總量顯著下降，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞[6]。本次實驗通過化學方法鍍銀后通過的打磨處理等，通過性能檢測如質(zhì)量檢測、厚度檢測、粗糙度檢測等，得到標準試件12個，分為三組硝酸銀的濃度分別為5g/L、3g/L、2g/L ，通過在培養(yǎng)基上對細菌培養(yǎng)并觀察在24小時后抑菌環(huán)的大小，跟空白試件(未鍍銀試件)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。根據(jù)三個實驗組數(shù)據(jù)的方差分析，得出鍍銀后的鈷鉻合金試件對白色念珠菌具有較強的抑制作用且當硝酸銀濃度為5g/L時抑菌效果為最好。同時在鍍銀的鈷鉻合金對細胞周期性、細胞凋亡同樣也有著很高的安全性，可以在臨床上廣泛使用[7]。因此，在抗菌材料領(lǐng)域，鍍銀鈷鉻合金材料以其價格便宜、廣譜且高效的抗菌效果、穩(wěn)定性強、生物安全性高等優(yōu)點，近些年來已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在口腔臨床材料中[8]。

由于鈷鉻合金表面的銀離子化學性質(zhì)較為活潑，長時間光照等因素的作用下容易發(fā)生還原反應(yīng)生成黑色的單質(zhì)銀，嚴重影響義齒的外觀，極大的限制在口腔中的應(yīng)用[9]。此外，化學鍍銀的方法無法較大程度提高材料中銀離子的濃度，依然是目前急需要解決的問題。本實驗證實鍍銀鈷鉻合金材料對白色念珠菌的抗菌性和生物安全性都十分良好，但將其投入到口腔臨床醫(yī)用材料的使用上依然需要進一步的研究。