張建鋒 時(shí)艷華 王獻(xiàn)紅 李建華 張洪杰 張玉蓉

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系內(nèi)兒教研室,鄭州 450064)

胎糞吸入綜合征(Meconium aspiration syndrome，MAS)是一種嚴(yán)重的新生兒呼吸衰竭，由胎兒宮內(nèi)氣喘或前幾次呼吸期間吸入胎糞引起的[1]。胎糞是新生兒的第一次大便，由羊水、黏液、膽汁、胎毛和皮膚及消化道細(xì)胞組成[2]。由胎糞引起的肺損傷是復(fù)雜的，可歸因于氣道的機(jī)械系阻塞、表面活性劑失活、化學(xué)性肺炎和肺動(dòng)脈高壓[3]。根據(jù)吸入胎糞的時(shí)間和數(shù)量，胎糞可能導(dǎo)致部分或完全氣道阻塞，導(dǎo)致肺泡過(guò)度充氣或肺不張。被困氣體可能會(huì)引發(fā)肺泡破裂，導(dǎo)致空氣泄露綜合征，如肺間質(zhì)性肺水腫、氣胸和肺炎支原體。盡管產(chǎn)科和新生兒護(hù)理有所改善，但其發(fā)病率和死亡率都很高，迫切需要更安全有效的治療選擇。蒲公英是一種菊科多年生草本植物，現(xiàn)代藥理研究表明蒲公英具有利膽、利尿、抗氧化、消炎和抗癌特性[4]。蒲公英的所有部分都可以用藥，尤其是富含多糖的根部，被廣泛用于臨床治療各種感染性和炎性疾病，如支氣管炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎等[5]。蒲公英提取物(Dandelion extract)是從傳統(tǒng)中藥蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)中提取而成，具有多種藥理作用。已有研究表明蒲公英提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用[6]。本文旨在研究蒲公英提取物對(duì)胎糞誘導(dǎo)的吸入性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 蒲公英全草(FCSPZYD7585)購(gòu)自北京同仁堂；地塞米松(SD953F0)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;蘇木素-伊紅染液(D006-1-1)、Masson染液(D026-1-3)、髓過(guò)氧化物酶測(cè)試盒(A044-1-1)、丙二醛測(cè)定試劑盒(A003-1-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Anti-TNF-α(ab6671)、IL-6 ELISA Kit(ab100712)、IL-1β、IL-8(ab7747)和MCP-1(ab9669)ELISA Kit(ab100704)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1蒲公英提取物制備[7]100 g蒲公英全草用紗布包裹，室溫下用水浸泡0.5 h，100℃加水提取3次：2 000 ml提取3 h，1 500 ml提取2 h，1 000 ml提取1 h。將3次提取液混合濃縮至100 ml，用0.22 μm注射器過(guò)濾器過(guò)濾并凍干，得到淡黃色粉末。

1.2.2動(dòng)物模型的建立[8]及分組 40只SD大鼠購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，1日齡。將大鼠用異氟烷(100 mg/kg)麻醉，置于手術(shù)臺(tái)，仰臥位，氣管切開(kāi)后插入氣管導(dǎo)管，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為四組：空白對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、地塞米松組(DEX)和蒲公英提取物組(Dandelion)?？瞻讓?duì)照組通過(guò)導(dǎo)管緩慢注入生理鹽水(1.5 ml/kg)，其余3組大鼠均注入胎糞(1.5 ml/kg)，所有大鼠呼吸機(jī)機(jī)械通氣30 min，確保生理鹽水均勻進(jìn)入支氣管及肺泡，縫合切口。地塞米松組靜脈注射地塞米松(0.5 mg/kg)，蒲公英提取物組靜脈注射蒲公英提取物(10.0 mg/kg)，空白對(duì)照組及模型組注射等量生理鹽水。12 h后所有大鼠放血至死，10%福爾馬林固定肺組織并進(jìn)行石蠟包埋。

1.2.3肺濕干重比值 取各組大鼠左肺葉稱(chēng)取濕重(W)，置于80℃烤箱烘烤24 h，稱(chēng)量干重(D)，計(jì)算濕干重比值(W/D)。

1.2.4動(dòng)脈血?dú)夥治?分別于建立模型前1 h，建立模型后1、3、6、12 h采集大鼠動(dòng)脈血，用血?dú)夥治鰞x測(cè)定PaO2。

1.2.5HE染色 采用蘇木素-伊紅(H-E)染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤(rùn)濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無(wú)水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測(cè)。

1.2.6Masson染色 用蒸餾水潤(rùn)濕玻片60 s，將組織用核染液染色60 s，棄去核染色液后用沖洗液沖洗30 s，漿染液染色60 s，棄去漿染液，沖洗液沖洗30 s，黃色分色液分色8 min，棄去分色液后直接用藍(lán)色復(fù)染液染色5 min，棄去藍(lán)色復(fù)染液，用無(wú)水乙醇沖洗干凈，吹干，無(wú)毒環(huán)保封固劑封片。在熒光顯微鏡下觀測(cè)。

1.2.7ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔加到96 孔酶標(biāo)板，將抗原包被過(guò)夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.8MPO、MDA 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定大鼠血清中髓過(guò)氧化物酶(MPO)，肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)活力,1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，在460 nm處測(cè)MPO吸光度值，在532 nm處測(cè)MDA吸光度值。

2 結(jié)果

2.1蒲公英提取物減輕病理?yè)p傷 HE染色結(jié)果如圖1所示。Control組肺泡壁完好無(wú)增厚、無(wú)炎性浸潤(rùn)、無(wú)充血。Model組大鼠肺組織表現(xiàn)明顯病理?yè)p傷、肺泡壁結(jié)構(gòu)不完整、出血、水腫嚴(yán)重、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織實(shí)化。DEX組可見(jiàn)明顯肺泡壁增厚、輕度出血、水腫、廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Dandelion組肺泡壁輕微增厚、中度出血、水腫彌散性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色顯示Control組大鼠肺組織未發(fā)生明顯纖維化。Model組大鼠肺組織大量區(qū)域被染為藍(lán)色，呈現(xiàn)高纖維化。DEX組大鼠肺組織部分區(qū)域被染為藍(lán)色。Dandelion組少量區(qū)域被染為藍(lán)色，纖維化程度低。

2.2蒲公英提取物下調(diào)PaO2水平 檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血氧分壓，結(jié)果如圖2所示：Model組PaO2水平12 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)極顯著低于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組PaO2水平極顯著高于Model組(P<0.01)。

2.3蒲公英提取物降低W/D比值 檢測(cè)各組大鼠肺濕干重比值(W/D)，如圖3所示：Control組W/D值顯著低于Model組(P<0.05)，DEX、Dandelion組W/D值顯著低于Model組(P<0.05)。

2.4血清炎癥因子水平 檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平，如表1所示：與Control組相比較，Model組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平顯著升高(P<0.01)，DEX、Dandelion組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平顯著低于Model組。

2.5肺泡灌洗液中炎癥因子水平 檢測(cè)肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平，結(jié)果如表2所示：與Control組相比較，Model組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平顯著升高(P<0.01)，Model組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平極顯著高于DEX組(P<0.01)，Dandelion組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平極顯著高于DEX組(P<0.01)。

2.6蒲公英提取物抑制MPO、MDA活力 檢測(cè)血清中MPO和肺MPO、MDA活力，如表3所示：Model組血清中MPO活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組血清中MPO活力極顯著低于Model組(P<0.01)；Model組肺MPO活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組肺MPO活力極顯著低于Model組(P<0.01)；Model組肺MDA活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組肺MDA活力極顯著低于Model組(P<0.01)。

圖1 肺組織病理?yè)p傷情況Fig.1 Pathological injury of lung tissue

圖2 動(dòng)脈血?dú)夥治鯢ig.2 Arterial blood gas analysisNote:*.P<0.05 vs control group；##.P<0.01 vs model group.

圖3 肺濕干重比值Fig.3 Ratio of wet to dry lung weightNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

表1 血清炎癥因子水平

Tab.1 Serum levels of inflammatory cytokines

GroupsSerum TNF-α(pg/ml)Serum IL-6(pg/ml)Serum IL-1β(pg/ml)Serum IL-8(pg/ml)Serum MCP-1(pg/ml)Control47.14±5.34 29.10±2.5147.15±4.25 98.08±5.2387.63±9.36 Model159.31±20.461)98.05±9.351)136.64±14.471)168.19±8.361)267.59±16.781)DEX55.61±4.542)36.32±3.862)63.84±5.532)118.84±4.372)129.71±11.252)Dandelion73.98±6.392)48.76±5.062)79.34±8.102)125.58±8.432)142.36±9.252)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表2 BALF中炎癥因子水平

Tab.2 Levels of inflammatory cytokines in BALF

GroupsBALF TNF-α(pg/ml)BALF IL-6(pg/ml)BALF IL-1β(pg/ml)BALF IL-8(pg/ml)BALF MCP-1(pg/ml)Control27.36±6.98346.27±6.3136.29±3.8128.29±5.7449.38±7.31Model62.93±3.641)436.33±4.321)66.52±4.361)45.82±6.631)75.86±5.561)DEX43.26±2.622)360.52±3.812)42.33±5.642)32.41±5.192)65.76±6.632)Dandelion47.17±4.152)378.24±6.562)52.91±2.912)34.92±6.852)67.86±6.972)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表3 檢測(cè)MPO,MDA活力

Tab.3 Detected MPO and MDA activity

GroupsSerumMPO(U/L)Lung MPO(U/g prot)Lung MDA(nmol/mg prot)Control141.35±18.340.53±0.060.89±0.12Model245.06±12.361)0.93±0.101)2.08±0.451)DEX123.66±13.402)0.61±0.062)0.91±0.092)Dandelion143.98±16.392)0.76±0.062)1.52±0.182)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

3 討論

胎糞吸入綜合征是新生兒肺損傷和呼吸衰竭的主要原因，發(fā)病率約為0.5%，死亡率在發(fā)展中國(guó)家居高不下[9]。胎糞可以趨化嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并通過(guò)肺微血管膜觸發(fā)其泄漏[10]。目前胎糞吸入綜合征的常規(guī)治療包括產(chǎn)時(shí)和產(chǎn)后口腔抽吸，然而這些技術(shù)并沒(méi)有降低胎糞吸入綜合征的發(fā)病率，在治療胎糞吸入綜合征的藥物，如抗生素、消炎藥、血管擴(kuò)張劑等，只有吸入一氧化氮和表面活性劑才能減少胎糞吸入綜合征患兒體外膜肺氧合的需要[11]。因此，基于對(duì)胎糞吸入綜合征病理生理學(xué)的更好理解，發(fā)現(xiàn)療效好無(wú)副作用的藥物是重要的。

蒲公英是一種分布于世界各地的食用植物，屬于菊科，被認(rèn)為是最耐受的藥用植物之一，幾乎沒(méi)有記錄的副作用。由于蒲公英含有植物性膽固醇，具有利尿和抗炎特性，長(zhǎng)期以來(lái)一直在臨床上使用[12]。已有研究證明蒲公英提取物顯示出針對(duì)肺損傷的有利治療作用。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英水提取物通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥產(chǎn)生抗炎作用。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物通過(guò)降低脂多糖誘導(dǎo)的肺MPO活性，增加SOD活性，減輕肺組織損傷。本文研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物具有升高胎糞誘導(dǎo)的吸入性肺損傷大鼠PaO2的水平，減輕肺組織病理?yè)p傷程度的作用。

水腫不僅是全身炎癥的典型癥狀，也是局部炎癥的典型癥狀，為了量化肺水腫的程度，我們?cè)u(píng)估了肺的W/D比值。在此，我們發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物能降低肺的W/D比值，說(shuō)明蒲公英提取物能抑制漿液向肺組織滲漏，減輕肺水腫的發(fā)生。

胎糞誘導(dǎo)的肺部炎癥在胎糞吸入綜合征的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，蒲公英長(zhǎng)期用于治療包括炎癥在內(nèi)的人類(lèi)疾病，這種抗炎作用可能是通過(guò)減少一氧化氮、前列腺素、TNF-α、IL-1β、IL-6和環(huán)氧合酶(COX)-2對(duì)巨噬細(xì)胞的作用產(chǎn)生的[14]。胎糞在肺內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，引發(fā)肺毛細(xì)血管炎性滲出，炎性細(xì)胞參與其中并釋放相關(guān)炎性介質(zhì)，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致肺損傷[15]。Berdeli等[16]研究發(fā)現(xiàn)胎糞通過(guò)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞增加IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物通過(guò)降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)可預(yù)防結(jié)腸炎。本文研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物具有降低血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1表達(dá)的作用，從而降低肺部炎癥。說(shuō)明蒲公英提取物通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子改善大鼠吸入性肺損傷。

MPO是中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒所釋放的過(guò)氧化物酶，MPO活性反映了肺中性粒細(xì)胞的附著和邊緣化[18]。中性粒細(xì)胞在細(xì)胞外培養(yǎng)基中排泄MPO，導(dǎo)致HOCI和其他幾種活性氧衍生物的積累，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化修飾[19]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，并在一定程度上顯示出了氧化應(yīng)激的水平[20]。Lu等[21]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物通過(guò)降低肺MPO、MDA活性減輕胎糞誘導(dǎo)的吸入性肺損傷。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物可通過(guò)降低MDA活性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，吸入性肺損傷新生大鼠肺MDA活力升高，表明吸入胎糞破壞肺組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而加入蒲公英提取物后，MDA活力降低，表明蒲公英提取物具有抗氧化作用，且蒲公英提取物極顯著降低大鼠血清MPO及肺MPO活性，表明蒲公英提取物可以抑制胎糞誘導(dǎo)的吸入性肺損傷發(fā)展過(guò)程中中性粒細(xì)胞的作用和浸潤(rùn)。

總的來(lái)說(shuō)，本研究揭示了蒲公英提取物對(duì)吸入性肺損傷新生大鼠的保護(hù)作用：減輕肺組織病理?yè)p傷程度，升高PaO2水平，降低肺的W/D比值，降低血清和肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1的表達(dá)，降低大鼠血清MPO活性及肺MPO、MDA活性。本研究結(jié)果闡明了蒲公英提取物具有治療胎糞吸入綜合征的潛力，下一步計(jì)劃針對(duì)蒲公英提取物改善胎糞吸入綜合征的作用機(jī)制及合適的給藥方案與是否存在不良反應(yīng)作進(jìn)一步研究。