王海波 史有陽(yáng) 馮 俊 倪騰洋 金 鳳 戴小軍 錢(qián)亞云 砂川正隆 劉延慶

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001)

痛風(fēng)是長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、尿酸排泄減少，血尿酸增高而引起組織損傷的一組臨床綜合征[1]。臨床上以高尿酸血癥同時(shí)伴有關(guān)節(jié)的紅、腫、熱、痛和關(guān)節(jié)活動(dòng)不利等臨床特征[2,3]。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率呈現(xiàn)低齡化和上升的趨勢(shì)[4]，高尿酸血癥和痛風(fēng)已成為我國(guó)中老年男性的常見(jiàn)病[5，6]。其主要特征是尿酸鹽晶體沉積所致的相關(guān)性關(guān)節(jié)病，該病的發(fā)生與高尿酸血癥直接相關(guān)，高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)病最重要的生化基礎(chǔ)[7]。因此痛風(fēng)的治療根本在于降低血尿酸的水平，同時(shí)對(duì)臨床癥狀進(jìn)行治標(biāo)[8]。目前，治療痛風(fēng)與高尿酸血癥仍以西藥為主，通常選用別嘌呤醇或者秋水仙堿等[9-11]。這些藥物雖然可以短期內(nèi)有效緩解或治療高尿酸血癥與痛風(fēng)，但是其毒副作用如嘔吐、惡心以及痙攣性腹痛等也很明顯[12-14]。而且通常只能短期緩解痛風(fēng)的臨床癥狀，并不能從根本上徹底治愈痛風(fēng)。因此，尋找和開(kāi)發(fā)更為有效而毒副作用更低的抗痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物顯得尤為重要與急迫。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不少臨床研究表明，中醫(yī)藥治療痛風(fēng)能夠取得明顯的療效[15-17]。此外，針對(duì)痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀和并發(fā)癥的藥物研究也證明了中醫(yī)藥治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的確切療效[18，19]。結(jié)果表明，中醫(yī)藥防治高尿酸血癥具有副作用少和整體療效明顯等優(yōu)勢(shì)，而且可以長(zhǎng)期服用，易被患者接受。本實(shí)驗(yàn)研究的復(fù)方取自劉延慶教授長(zhǎng)期治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有豐富的臨床有效樣本積累；并且該復(fù)方用于治療痛風(fēng)已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)(專利號(hào)：201610960451.9)。

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)模型動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)該復(fù)方的確切療效和相應(yīng)的有效炎癥分子靶點(diǎn)，同時(shí)驗(yàn)證該復(fù)方短期服用后的肝腎毒性，為尋找和開(kāi)發(fā)高效低毒的治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用中藥 土茯苓(規(guī)格：1 kg，廠家：安徽惠隆中藥飲片有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：20140326，產(chǎn)地：廣西)；鬼箭羽(規(guī)格：1 kg，廠家：安徽惠隆中藥飲片有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：20150321，產(chǎn)地：浙江)；生苡仁(規(guī)格：1 kg，廠家：蘇州市天靈中藥飲片有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：150319010，產(chǎn)地：江蘇)；徐長(zhǎng)卿(規(guī)格：1 kg，廠家：安徽惠隆中藥飲片有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：20141224，產(chǎn)地：山東)。

1.1.2試劑 秋水仙堿(陽(yáng)性對(duì)照藥)(規(guī)格：0.5 mg，廠家：西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：150208)；生理鹽水 (NS)(規(guī)格：250 ml，廠家：四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；尿酸鈉晶體(MSU)(規(guī)格：15 mg，廠家：Sigma，貨號(hào)：U2875)；腺嘌呤(Adenine)(規(guī)格：25 g，廠家：Sigma，貨號(hào)：A8626)；氧嗪酸鉀鹽(Oxonic acid potassium salt)(規(guī)格：25 g，廠家：Sigma，貨號(hào)：156124)；羧甲基纖維素鈉 (Sodium carboxymethyl cellulose) (規(guī)格：100 g，廠家：Sigma，貨號(hào)：419273)；定制高酵母飼料(規(guī)格：2 kg，廠家：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物 Wistar 大鼠(雄性)，200 g體重，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1復(fù)方制備 煎煮生藥量為土茯苓1份，鬼箭羽1份，生苡仁1份，徐長(zhǎng)卿1份，放入1.5 L煎藥罐中，加入1 L水，浸泡1～2 h，于電磁爐上2 000 W檔大火煮開(kāi)，水開(kāi)后調(diào)到500 W繼續(xù)微微煮沸約1 h，期間用長(zhǎng)筷翻藥3～5次。煮好以后，用多層紗布過(guò)濾出湯液，冷卻備用。

1.2.2高尿酸血癥大鼠模型造模 Wistar大鼠喂食定制高酵母飼料，同時(shí)給予腺嘌呤100 mg/(kg·d)劑量灌胃，早晚各一次。與此同時(shí)給予氧嗪酸鉀懸液150 mg/(kg·d)劑量皮下注射2次，每次間隔12 h。每日定時(shí)尾靜脈取血，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血尿酸水平，連續(xù)3 d維持高水平視為造模成功。

1.2.3分組及給藥 確定造模成功后將大鼠分為陰性照組、模型組、給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組為正常飼養(yǎng)，未造模的大鼠。模型組為造模成功組同時(shí)灌服等體積超純水組。給藥組以10 g/(kg·d)劑量的復(fù)方灌胃。模型組以秋水仙堿0.3 mg/(kg·d)劑量灌胃。每日同一時(shí)間灌胃，連續(xù)灌胃10 d。

1.2.4樣品采集及處理 造模成功后連續(xù)給藥10 d，各組大鼠麻醉，剖殺大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分別裝進(jìn)1.5 ml EP管中和黃頭抗凝采血管中。全部采集完后將黃頭采血管中的血立即用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行分析，檢測(cè)血尿酸水平。取血時(shí)立即將1.5 ml EP管中的全血，進(jìn)行低溫離心(3 000 r/min，15 min)提取上層血清冷凍備檢。上層血清利用蛋白芯片進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)免疫炎癥因子。

1.2.5大鼠肝腎切片HE染色 造模成功后連續(xù)給藥10 d，各組大鼠麻醉，PBS等滲液灌注10 min，剖開(kāi)大鼠腹腔，取下大鼠的肝腎，剝離周?chē)闹炯澳そM織。將大鼠的肝腎浸泡在福爾馬林中，1周后取出大鼠肝腎組織石蠟包埋并切片，進(jìn)行HE染色，晾干切片備檢。

2 結(jié)果

2.1造模前后大鼠的尿酸水平 連續(xù)喂食定制高酵母飼料，同時(shí)給予腺嘌呤灌胃和氧嗪酸鉀懸液皮下注射連續(xù)9 d檢測(cè)到大鼠的血尿酸水平持續(xù)穩(wěn)定地處于高水平，與正常對(duì)照組相比血尿酸水平顯著增高(P<0.01)，見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示高尿酸血癥大鼠模型造模成功。

2.1給藥處理后大鼠的血尿酸水平 結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)連續(xù)10 d的給藥，該中藥復(fù)方能顯著降低模型組大鼠的血尿酸水平，與模型組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組的(秋水仙堿組)大鼠的血尿酸水平也明顯降低，與模型組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3給藥處理后痛風(fēng)相關(guān)免疫炎癥因子變化 造模成功后，不同組分別給予不同的處理，連續(xù)處理10 d后，利用蛋白芯片熱熒光技術(shù)對(duì)各組大鼠的血清進(jìn)行痛風(fēng)相關(guān)免疫炎癥因子的檢測(cè)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與模型組相比，該中藥復(fù)方能明顯降低痛風(fēng)相關(guān)免疫炎癥因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-13、TNF-α)的水平，對(duì)痛風(fēng)相關(guān)的炎癥因子具有明顯的抑制作用如圖3所示，結(jié)果說(shuō)明該中藥復(fù)方具有明顯的炎癥抑制作用。

2.4給藥處理后大鼠的短期肝腎毒性檢測(cè) HE染色后顯微鏡下觀察服藥后大鼠的肝腎組織形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后大鼠的肝腎組織細(xì)胞分布均勻，未見(jiàn)明顯的肝腎組織損傷，結(jié)果如圖4所示。

圖1 正常大鼠和模型組大鼠的血尿酸水平Fig.1 Serum uric acid levels in normal and model ratsNote:***.P<0.001 vs Model group.

圖2 給藥10 d后各組大鼠的血尿酸水平Fig.2 Blood uric acid level of rats in each group after 10 days administrationNote:**.P<0.01，***.P<0.001 vs Model group.

圖3 給藥10 d后各組大鼠的免疫炎癥因子水平Fig.3 Immune-inflammatory factor levels in rats of each group after 10 days administrationNote:*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs Model group.

圖4 給藥10 d后大鼠的肝腎切片HE染色照片F(xiàn)ig.4 HE staining photographs of liver and kidney sections of rats after 10 days administration

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究的復(fù)方，是在劉延慶教授長(zhǎng)期臨床運(yùn)用中，從大方中精簡(jiǎn)而來(lái)的。經(jīng)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明確實(shí)有效的一組最佳藥味和配比的精簡(jiǎn)復(fù)方。臨床使用經(jīng)驗(yàn)顯示該方能顯著緩解患者臨床癥狀，同時(shí)降低患者的血尿酸水平，達(dá)到標(biāo)本兼治的效果。這是很多治療痛風(fēng)的其他藥物所不能達(dá)到的，現(xiàn)在臨床常用的治療藥物大多是以緩解臨床癥狀為主，可以說(shuō)是治標(biāo)不治本。而本研究通過(guò)大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方可以明顯降低患病大鼠的血尿酸水平，而降低血尿酸水平是治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的根本所在[20]。目前臨床上還沒(méi)有一種特效藥可以顯著降低血尿酸水平的，該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示了該復(fù)方治療高尿酸血癥的良好效果。此外，高尿酸血癥會(huì)慢慢引起尿酸鹽的沉積，而尿酸鹽結(jié)晶會(huì)刺激和激活巨噬細(xì)胞引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子的分泌，從而導(dǎo)致一系列的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而形成急性關(guān)節(jié)炎。因此，本課題組同時(shí)檢測(cè)了痛風(fēng)可能引起臨床病理癥狀的相關(guān)免疫炎癥因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方能夠顯著降低模型組大鼠血液中IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-13和TNF-α的水平。IFN-γ是機(jī)體最重要的免疫效應(yīng)因子之一，能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK)活性，有研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清IFN-γ水平顯著上調(diào)，而抑制IFN-γ可以有效抑制痛風(fēng)和高尿酸血癥引起的炎癥反應(yīng)[21]。而本實(shí)驗(yàn)中，該中藥復(fù)方可以有效降低IFN-γ的水平，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。IL-1β是經(jīng)典炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑IL-1 的一種可與IL-2一起可以可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的功能和促進(jìn)代謝因子的表達(dá)，加速軟骨基質(zhì)降解和退化，因此抑制IL-1β和IL-2可以保護(hù)痛風(fēng)引起的骨損傷[22]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該復(fù)方可以有效抑制IL-1β和IL-2的表達(dá)，從而減緩?fù)达L(fēng)引起的骨損傷。此外，IL-4 和IL-2都能促使IgE的分泌、活化和聚集從而加重痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[23]。而該中藥復(fù)方可以顯著降低IL-4 和IL-2的表達(dá)水平，減輕痛風(fēng)引起的炎癥反應(yīng)。TNF-α屬于前炎癥細(xì)胞因子，在整個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是患者機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，具有局部促炎性反應(yīng)作用，刺激中性粒細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[24]。另外，IL-13和痛風(fēng)的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道，IL-13是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。而本實(shí)驗(yàn)中，該中藥復(fù)方可以有效降低TNF-α和IL-13的水平，抑制炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)過(guò)程，從而減少高尿酸血癥和痛風(fēng)引起的臨床癥狀。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明該復(fù)方能夠緩解高尿酸血癥和痛風(fēng)引起的病理性炎癥反應(yīng)，從而改善痛風(fēng)的臨床癥狀。與此同時(shí)本課題組還檢測(cè)了該復(fù)方短期服用對(duì)于大鼠肝腎的影響，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠的肝腎有明顯的組織損傷，這說(shuō)明短期內(nèi)該復(fù)方不會(huì)對(duì)肝腎功能造成影響。

綜上所述，該復(fù)方既可以從根本上降低血尿酸水平，同時(shí)明顯抑制痛風(fēng)引起的免疫炎癥反應(yīng)，改善痛風(fēng)和高尿酸血癥引起的臨床癥狀。不僅如此，短期內(nèi)服用該復(fù)方不會(huì)有明顯的肝腎毒副作用。這些研究結(jié)果為早日尋找和開(kāi)發(fā)效果好并且毒副作用小的抗痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是其中具體的作用方式及分子機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。