沈朝斌 郁 蘭 顧燕妮 王 嵩 陸 磊

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082)

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪飲片煎煮后經(jīng)高通量二代測(cè)序得到完整的miRNA譜系，包括黃芪所屬的保守的豆科類植物miRNA譜系和非保守的黃芪特有的miRNA譜系，而非保守的黃芪miRNA譜系中最重要以及含量最多的為高表達(dá)miR-396家族[1]。因此，本研究選用miR-396合成擬似物轉(zhuǎn)染了解在哮喘模型中對(duì)輔助性T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。黃芪為豆科多年生草本植物的根莖(Astragalus membranaceus.Fisch.)，中醫(yī)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)和益衛(wèi)固表等功效，用于肺氣虛、表虛自汗和氣虛外感等證，是最常用的中藥材之一，常配白術(shù)、防風(fēng)(玉屏風(fēng)散，黃芪作為君藥)用于兒童支氣管哮喘緩解期和反復(fù)呼吸道感染。先前研究表明，玉屏風(fēng)散對(duì)哮喘小鼠模型具有抑制Th2和Th17細(xì)胞炎癥因子的作用[2,3]。目前尚無(wú)植物miR-396轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物的報(bào)道。為進(jìn)一步明確中藥治療哮喘的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，本研究通過(guò)經(jīng)鼻滴注miR-396合成擬似物(mimic)(agomir)，觀察小鼠哮喘模型轉(zhuǎn)染后miR-396表達(dá)及哮喘相關(guān)免疫指標(biāo)，試圖詮釋黃芪中的miR-396基本藥理作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性BALB/c小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(22.38±0.79)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于長(zhǎng)海醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室(許可證：SYXK[滬]2015-2017)，自由攝取高溫滅菌后的飼料及飲用水，飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、哮喘模型組、miR-396轉(zhuǎn)染組、地塞米松治療組，每組10只。小鼠IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β和IFN-γ定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bioscience公司，miR-396 mimics(agomir)由上海吉瑪基因股份有限公司合成，TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，氯仿、異丙醇及無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1哮喘小鼠模型制備 模型組：在第0(實(shí)驗(yàn)當(dāng)天)、7、14天分別予1% OVA混懸液腹腔注射0.2 ml致敏3次，第21、23、25天以0.4% OVA溶液滴鼻激發(fā)3次，間隔2周后，第39、41、43天予0.4% OVA溶液滴鼻再次激發(fā)3次?？瞻捉M：同樣時(shí)間和方式以生理鹽水代替OVA混懸液(溶液)及藥物分別進(jìn)行腹腔注射及滴鼻。

miR-396轉(zhuǎn)染組：致敏、激發(fā)階段的方法同模型組，OVA再次激發(fā)30 min后(第39天起)，將20 μg miR-396 agomir(無(wú)核酶水溶解后濃度為5 μg/μl)加入到0.9% 氯化鈉溶液中配置成5 ml 轉(zhuǎn)染溶液，每只小鼠經(jīng)鼻滴入200 ng，隔日一次，連續(xù)7次。地塞米松組：致敏、激發(fā)階段的方法同模型組，OVA再次激發(fā)30 min后(第39天起)，腹腔注射地塞米松0.2 ml(5 mg/ml)治療，隔日一次，連續(xù)7次。

1.2.2肺勻漿的收集和組織標(biāo)本保存 小鼠末次治療7 d后(第58天)予苯巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，取完整左肺，4℃生理鹽水3 ml研磨，回收肺勻漿約1.5 ml/小鼠，即放入-20℃冷藏，2 h后置-80℃凍存，待測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子。

1.2.3組織miR-396 表達(dá)的測(cè)定 分別取小鼠肺勻漿0.5 ml、脾臟0.5 g和外周血0.5 ml，以1∶9 容積加入TRIzol溶液，提取完整總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度。miR-396反轉(zhuǎn)錄采用TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和特異miRNA 莖環(huán)引物，反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。miR-396 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)采用TaqMan miRNA 檢測(cè)試劑盒，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃ 15 s，60℃ 60 s)。在ABI 7500 定量 PCR 儀上擴(kuò)增和檢測(cè)。選取U6 snRNA 作為內(nèi)參。

1.2.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá) 取小鼠肺勻漿1 ml，2 700 g離心5 min，上清液-4℃保存待測(cè)。對(duì)肺勻漿先進(jìn)行蛋白定量測(cè)試，濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化處理。采用小鼠ELISA試劑盒，根據(jù)Bioscience公司操作說(shuō)明書(shū)步驟，并通過(guò)OD值計(jì)算IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17A及TGF-β的濃度。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá) 脾臟組織按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增均由上?；鶢栴D基因公司完成，引物設(shè)計(jì)合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成(表1)。選取GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.6肺部病理檢查 取完整右肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定，脫水石蠟包埋制備石蠟切片，脫蠟后使用蘇木素-伊紅(HE)染色，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察病理學(xué)改變。

表1 輔助性T細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子RT-PCR擴(kuò)增引物

Tab.1 Specific PCR primers for amplifying in master transcription factors of T helper cells

Transcription factorsSequence(5'→3')T-betsenseCAACAACCCCTTTGCCAAAGantisenseTCCCCCAAGCAGTTGACAGTGATA-3senseGAGGTGGACGTACTTTTTAACATCGantisenseGGCATACCTGGCTCCCGTSTAT-6senseTGAGGTGGGGACCAGCCGGantisenseTGAGGAAACCAGGCATCCTGAACTROR-γtsenseGTGACCAGGACACACAGCGGantisenseTGAGGAAACCAGGCATCCTGAACTFoxp-3senseTGTGTGGTTGTTGGCATTGTAGGCantisenseCTGTGACCATCCCCTCATCT

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染miR-396 后小鼠肺臟、脾臟和外周血miR-396 表達(dá)結(jié)果 miRNA-396轉(zhuǎn)染表達(dá)以脾臟為最高，表達(dá)量為U6內(nèi)參的(13.87±2.05)倍；外周血次之，表達(dá)量為(12.62±1.65)倍；肺部表達(dá)為(10.69±1.27)倍(圖1)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子水平的影響 哮喘模型組IFN-γ和TGF-β水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，而IL-5、IL-13和IL-17A水平顯著增高(P<0.05)。miR-396轉(zhuǎn)染組均能顯著糾正各細(xì)胞因子改變，以IL-5、IL-13、IL-17A和TGF-β最為顯著(P<0.001)。轉(zhuǎn)染組IFN-γ與哮喘模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(14.99±2.15 vs 19.81±6.01，P值為0.018，P<0.05)；轉(zhuǎn)染組與地塞米松治療組比較，在提高IFN-γ水平方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(19.81±6.01 vs 25.65±6.32，P值為0.079，P>0.05)。轉(zhuǎn)染miR-396可顯著抑制哮喘IL-5和IL-13水平(分別為52.26±4.19 vs 74.23±7.53、16.11±4.86 vs 30.81±3.16，均P<0.001)；其抑制作用優(yōu)于地塞米松治療組(52.26±4.19 vs 66.42±6.74和16.11±4.86 vs 27.33±5.39，均P<0.01)。轉(zhuǎn)染組IL-17A顯著低于哮喘模型組(39.25±4.37 vs 94.43±9.46，均P<0.001)，但對(duì)IL-17A的抑制作用顯著低于地塞米松治療組(39.25±4.37 vs 30.06±3.37，P<0.001)。轉(zhuǎn)染miR-396可顯著提高哮喘模型組TGF-β水平(43.74±10.14 vs 20.71±3.63，P<0.001)，但作用顯著低于地塞米松(43.74±10.14 vs 97.11±16.44，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2和圖2)。

圖1 miR-396轉(zhuǎn)染后小鼠肺臟、脾臟和外周血miR-396 表達(dá)Fig.1 Quantitation of miR-396 mimic detectable by PCR in different tissues of lung,peripheral blood and spleen of transfected miceNote:Expression levels of the miR-396 were normalized to level of U6 as a control miRNA using the 2-ΔΔCt method(fold).

表2 轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子水平的影響

Tab.2 Effect of miR-396 mimic on expression levels of various cytokines by T helper cells in pulmonary homogenates

Cytokines(ng/ml)Control group(n=10)Asthma model group(n=10)Transfect group(n=10)Dexamathasone group(n=9)IFN-γ25.60±5.4514.99±2.1519.81±6.011)25.65±6.322)IL-556.18±6.4774.23±7.5352.26±4.193)66.42±6.741)IL-1320.99±5.9030.81±3.1616.11±4.863)27.33±5.392)IL-17A63.43±15.8194.43±9.4639.25±4.373)30.06±3.373)TGF-β128.00±17.5320.71±3.6343.74±10.143)97.11±16.443)

Note：The levels of Th cytokines were measured by ELISA.1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001,compared with the asthma model group.

圖2 轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子水平的影響Fig.2 Effect of miR-396 mimic on expression levels of various cytokines by T helper cells in pulmonary homogenatesNote:The levels of Th1 cytokine(IFN-γ),Th2 cytokines(IL-5 and IL-13),Th17 cytokine(IL-17A),and Treg cytokine(TGF-β)were measured by ELISA.

表3 轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠脾臟Th細(xì)胞mRNA的影響(2-ΔΔCt值)

Tab.3 Transfect miR-396 mimic on expression of transcription factors mRNA of helper T cells in spleen(2-ΔΔCt)

GroupsFoxp-3T-betROR-γtSTAT-6GATA-3Control11111Asthma model0.10±0.030.15±0.0236.35±1.674.57±0.6712.36±1.03miR-396 mimics0.22±0.040.25±0.028.40±1.743)3.71±0.234.46±0.433)Dexamethasone0.58±0.071)0.63±0.031)3.74±0.893)1.44±0.122)7.06±0.693)

Note：The each mRNA level of transcription factor compared with the control group(is conventionally set to be 1 fold).Total RNAs were extracted from spleen tissues and the levels of mRNAs were determined via RT-PCR.GAPDH served as an internal control.The comparative Ct method(2-ΔΔCt)was used to quantify gene expression levels.1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001,compared with the asthma group.

圖3 轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠脾臟Th細(xì)胞mRNA的影響Fig.3 Effects of transfect miR-396 inhibition on expression mRNA levels of master transcription factors asso-ciated with T cells in spleen of mice asthma modelNote:Total RNAs were extracted from spleen tissues and the levels of mRNAs were determined via RT-PCR.GAPDH served as an internal control.The comparative Ct method(2-ΔΔCt)was used to quantify gene expression levels.

圖4 miR-396 表達(dá)對(duì)哮喘小鼠肺部病理的影響Fig.4 Inhibition of airway inflammation in a OVA allergen model mice of asthma by miR-396 mimicNote:Representative photomicrographs of HE-stained lung sections from mice of asthma model(A,B)and transfect miR-396(C,D)groups are shown.

2.3轉(zhuǎn)染miR-396對(duì)哮喘小鼠Th細(xì)胞mRNA的影響 哮喘模型組Th細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與對(duì)照組表達(dá)比較：Th1細(xì)胞的T-bet降低；Th2細(xì)胞的STAT-6顯著增高，GATA-3顯著增高；Th17細(xì)胞的ROR-γt 顯著增高；Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3降低。miR-396轉(zhuǎn)染后Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA與哮喘組比較，表達(dá)結(jié)果比較：Th1細(xì)胞的T-bet表達(dá)增高0.66倍；Th2細(xì)胞的STAT-6表達(dá)下降；GATA-3表達(dá)顯著降低；Th17細(xì)胞的ROR-γt表達(dá)顯著降低；Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著增高。地塞米松治療組Th細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與哮喘組比較，Th1細(xì)胞的T-bet 表達(dá)顯著增高；Th2細(xì)胞的STAT-6表達(dá)顯著降低，GATA-3表達(dá)降低；Th17細(xì)胞的ROR-γt 表達(dá)顯著降低；Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著增高。結(jié)果提示：miR-396轉(zhuǎn)染最主要的作用是抑制和降低Th2細(xì)胞GATA-3的表達(dá)；miR-396轉(zhuǎn)染后對(duì)抑制哮喘Th2細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)的作用優(yōu)于地塞米松治療組，但在降低Th2細(xì)胞STAT-6和Th17細(xì)胞ROR-γt的表達(dá)以及提高Th1細(xì)胞T-bet和Treg細(xì)胞Foxp3的表達(dá)方面，地塞米松的作用似乎優(yōu)于轉(zhuǎn)染miR-396(表3和圖3)。

2.4轉(zhuǎn)染miR-396 對(duì)哮喘小鼠肺部病理的影響 經(jīng)OVA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠哮喘模型肺部病理可見(jiàn)支氣管呈復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞改變，排列紊亂，頂漿分泌多見(jiàn)，間質(zhì)見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴充血，肺泡顯著減少，大量肺泡結(jié)構(gòu)消失(見(jiàn)圖4A、B)。經(jīng)miR-396轉(zhuǎn)染后，肺部病理切片可見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，仍見(jiàn)頂漿分泌，部分間質(zhì)可見(jiàn)充血，黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，肺泡結(jié)構(gòu)大部分恢復(fù)，結(jié)構(gòu)清晰(見(jiàn)圖4C、D)。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用了經(jīng)熱力學(xué)處理的(煎煮后)黃芪中高表達(dá)miR-396家族合成擬似物(mimic)作為哮喘治療的生物制劑，并與腎上腺皮質(zhì)激素(標(biāo)準(zhǔn))治療對(duì)照。

小干擾性RNA(small/short interfering RNA,siRNA)是一類18～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈RNA分子，其主要在RNA干擾(RNAi)通路中起干擾特異基因表達(dá)的作用?；蛞种频挠行院艽蟪潭壬先Q于目的基因序列的選擇。根據(jù)本課題組前期研究的黃芪miRNA譜系分析，選擇黃芪高表達(dá)非保守特征性的miR-396家族序列，采用了體外合成擬似物，并與人和小鼠的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST)進(jìn)行比較，排除了其他編碼序列/表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags,ESTs)同源的序列干擾。通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA導(dǎo)致功能性基因沉默是一種成熟的治療各種基因異常疾病的策略，在細(xì)胞漿中，雙鏈siRNA介導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)特異性降解靶向mRNA，從而抑制目標(biāo)蛋白合成[4,5]。

植物外源性的miRNA能否進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)并持續(xù)表達(dá)是有爭(zhēng)議的，以往認(rèn)為外源性miRNA在哺乳動(dòng)物的外周血和組織中是高度不穩(wěn)定的，但近十年的研究證明，外源性miRNA可以經(jīng)受極端pH值和耐受核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)的活性，并穩(wěn)定存在于哺乳動(dòng)物外周血中[6-8]。也有研究開(kāi)創(chuàng)性地提出，病毒和草藥等來(lái)源的miRNA可能可以跨越物種(cross-kingdom)而起作用[9-12]。本研究結(jié)果表明，miR-396擬似物可以進(jìn)入小鼠體內(nèi)，并高表達(dá)在脾臟、外周血和肺部。因miR-396為黃芪來(lái)源的植物性外源性特征性miRNA，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)并不存在，所以在PCR檢測(cè)中無(wú)需與空白對(duì)照組比較，僅需與內(nèi)參基因相對(duì)照，小鼠組織中表達(dá)的植物miRNA結(jié)果應(yīng)該是可靠和可信的。

玉屏風(fēng)散是目前我國(guó)推薦治療兒童哮喘的中成藥[13,14]，其配伍組方中的君藥為黃芪。該經(jīng)方在我們先前的研究中也被反復(fù)證實(shí)了對(duì)哮喘小鼠有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)Th2細(xì)胞所分泌的Ⅱ類炎癥因子具有抑制作用[2,3]；2008年我們發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠所導(dǎo)致的Th17細(xì)胞分泌的IL-17也有很好的抑制作用[15]；不僅如此，在哮喘小鼠使用玉屏風(fēng)散治療后，與免疫相關(guān)的miRNA也發(fā)生了變化[16]。為此，我們對(duì)熱力學(xué)處理后(經(jīng)煎煮后)玉屏風(fēng)散及各味飲片進(jìn)行高通量二代測(cè)序(High throughput next generation sequence, NGS)，得到各組分的miRNA譜系，尤其對(duì)方劑組成中的君藥黃芪進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到非保守高表達(dá)的miR-396家族[1]。

哮喘免疫異常主要為T(mén)h1/Th2細(xì)胞的失衡，尤其是Th2細(xì)胞所分泌的IL-5和IL-13顯著增高所導(dǎo)致的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和血清IgE合成增加；最近研究認(rèn)為炎癥因子和外周血的這些指標(biāo)也是哮喘治療療效判斷的重要依據(jù)[17]。本次實(shí)驗(yàn)主要是將miR-396擬似物轉(zhuǎn)染至哮喘小鼠，結(jié)果表明它對(duì)Ⅱ類炎癥細(xì)胞因子的有很好的抑制作用，尤其對(duì)IL-5和IL-13的抑制作用優(yōu)于地塞米松；雖然miR-396擬似物轉(zhuǎn)染對(duì)IL-17的抑制以及對(duì)IFN-γ和TGF-β的提升均存在高度顯著性差異，但其作用均弱于地塞米松治療組。同時(shí)，本次研究對(duì)輔助性T細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子mRNA檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞因子變化水平基本吻合。轉(zhuǎn)染miR-396組小鼠Th2細(xì)胞GATA-3 mRNA表達(dá)較哮喘模型組顯著下降；而Th17細(xì)胞的ROR-γt mRNA 表達(dá)顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-396組GATA-3 mRNA的抑制程度優(yōu)于地塞米松治療組，而對(duì)ROR-γt mRNA 表達(dá)抑制程度低于地塞米松組。miR-396轉(zhuǎn)染對(duì)T-bet、STAT-6和Foxp-3 mRNA表達(dá)均無(wú)顯著作用，而地塞米松治療組既能提高哮喘小鼠Th1細(xì)胞T-bet和Treg細(xì)胞TGF-β的mRNA表達(dá)，同時(shí)對(duì)Th2細(xì)胞的STAT-6的mRNA表達(dá)也有顯著的抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，地塞米松對(duì)哮喘的免疫調(diào)節(jié)是較為全面的，僅僅單個(gè)miRNA擬似物不能全面逆轉(zhuǎn)哮喘的免疫病理狀況；反之，如果中藥單味藥或組方，即植物miRNA完整譜系的給予可能具有更好的全面的免疫調(diào)節(jié)作用，這可能解釋了本課題組前期研究的結(jié)果[2,3]。經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-396的哮喘小鼠肺部病理也能觀察到黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和充血顯著減少，肺泡重新開(kāi)放，支氣管和小支氣管上皮細(xì)胞排列規(guī)整程度改善，也證明了miR-396擬似物對(duì)哮喘小鼠具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

本次實(shí)驗(yàn)首次證明了經(jīng)熱力學(xué)處理后的中藥miRNA是可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)的，也說(shuō)明了煎煮后的草藥所含有的植物來(lái)源的miRNA可能是具有藥理作用的活性物質(zhì)。換而言之，植物藥中除次生代謝產(chǎn)物外(如黃芪中含有黃酮類和皂甙類物質(zhì)等)，小分子的miRNA可能是另一類重要的活性成分，有望成為RNAi新的生物制劑，同時(shí)也為類似的植物藥機(jī)制研究提供了一種新的方法[18]。黃芪中新的非保守和高表達(dá)的miR-396家族轉(zhuǎn)染在哮喘小鼠具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，其可能機(jī)制為抑制Th2細(xì)胞的GATA-3表達(dá)從而減少I(mǎi)L-5和IL-13產(chǎn)生，緩解哮喘的炎癥病理狀況。

植物來(lái)源的miRNA轉(zhuǎn)染的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系、在體內(nèi)的表達(dá)持續(xù)時(shí)間以及RISC形成的具體作用部位有待進(jìn)一步的深入研究去證明。另一方面，miR-396家族核苷酸序列在人類具有潛在的多個(gè)可能的靶基因作用位點(diǎn)，包括：cAMP調(diào)節(jié)磷蛋白異構(gòu)體19(cAMP-regulated phosphoprotein 19 isoform)、DNA結(jié)合蛋白R(shí)FX7(DNA-binding protein RFX7)和鉀/鈉超極化環(huán)核苷肽通道1(Potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel)等73個(gè)相匹配的基因位點(diǎn)(http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)，轉(zhuǎn)染miR-396在體內(nèi)的作用過(guò)程可能十分復(fù)雜。

某種程度上，黃芪煎煮液提取的高度保守高表達(dá)的12種Ⅰ類miRNA分子，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了9個(gè)非保守高表達(dá)的黃芪特有的miRNA分子，除miR-166i和miR-5077外，7個(gè)屬miR-396家族成員，從理論上均具有潛在的RNAi作用，用單一合成miRNA擬似物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的意義可能僅僅是在植物藥治病的免疫調(diào)節(jié)基礎(chǔ)理論上獲取一些現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的證據(jù)，但深入研究劑量依賴(涉及中藥服用持續(xù)時(shí)間)和明確靶基因干擾作用部位可能對(duì)植物藥今后的研究具有方法學(xué)上的探索意義。