張 楠 祁曉媛 潘思培 鄭曉露 酈錚錚

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，溫州 325000)

缺血性腦卒中是一類常見、高發(fā)病率、高致殘率的腦血管病，目前已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康[1]。而腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CI/R)是由于在腦缺血一段時間后恢復(fù)血液灌流而出現(xiàn)炎癥損傷加劇的一種現(xiàn)象[2]，其機(jī)制是恢復(fù)血液灌流后腦內(nèi)會引發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載等，是腦血管損傷的主要原因，因而對其進(jìn)行有效防治和治療有很重要的意義[3]。目前已在許多植物中發(fā)現(xiàn)對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用的物質(zhì)，如川芎油[4]、拳參提取物PBNA-413[5]、蕎麥黃酮[6]、黃芩苷和梔子苷[7]等。香葉木素(3′，5,7-三羥基-4′-甲氧基黃酮，C16H12O6，Diosmetin)是一種天然黃酮類化合物，主要以游離型或糖苷型存在于菊花、柑橘屬類果實、橄欖樹葉等天然藥物中，具有抗炎、抗腫瘤、殺菌、抗氧化等多種藥理效果[8-13]。而且由于香葉木素在日常飲食中容易獲取，因而具有很好的藥用價值和開發(fā)潛力。然而關(guān)于香葉木素對于缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，目前少有報道。因此本文采用線栓法制備CI/R損傷大鼠模型，通過觀察不同劑量香葉木素對該模型大鼠行為和腦梗死體積的影響以及腦組織損傷情況，檢測不同處理后腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、炎癥因子以及CysLTs含量的變化，最終驗證香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠是否有保護(hù)作用，以期為缺血再灌注損傷找到更好的治療預(yù)防藥物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 青壯年雄性SD大鼠(體質(zhì)量250～300 g，7～8周齡)72只，四川大學(xué)實驗動物中心，合格證號：046。

1.1.2藥物與試劑 香葉木素(HPLC≥98%)(Solarbio)；尼莫地平(陽性對照，拜耳)；蘇木素染液、伊紅染液(南京凱基)；酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(ELISA，武漢默沙克生物科技有限公司)；10% 水合氯醛(山東華魯制藥有限公司)；SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；半胱天冬酶3(Caspase 3)、活化型半胱天冬酶3(Cleaved caspase 3)、Caspase 9、Cleaved caspase 9、GAPDH一抗(美國CST公司)；二抗(美國LICOR公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)；蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(美國羅氏公司)。

1.1.3儀器 UV1000 紫外可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；顯微鏡(德國卡爾蔡司股份公司)。

1.2方法

1.2.1CI/R損傷大鼠模型的制備 采用MCAO線栓法參照文獻(xiàn)[14]構(gòu)建CI/R大鼠模型，具體步驟如下：將大鼠用10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定在操作臺上。于頸部正中切開，分離右側(cè)股靜脈、左右兩側(cè)頸總動脈、椎動脈和右側(cè)頸外動脈并結(jié)扎，缺血2 h后拔線。大鼠清醒后采用Longa評分標(biāo)準(zhǔn)來檢測是否造模成功，1～3分視為成功[14,15]。

1.2.2分組 將72只大鼠隨機(jī)分為6組，每組各12只：假手術(shù)組、CI/R組、尼莫地平組[6 mg/(kg·h)]、香葉木素(0.25 mg/kg)、香葉木素(0.5 mg/kg)、香葉木素(1 mg/kg)。假手術(shù)組同樣分離出相應(yīng)血管，但不進(jìn)行結(jié)扎；香葉木素各濃度組在CI/R制作前 6 h 進(jìn)行香葉木素腹腔注射預(yù)處理，再灌注24 h后檢測各項指標(biāo)。假手術(shù)組和CI/R組給予同體積的生理鹽水。

1.2.3大鼠神經(jīng)功能缺陷評分 缺血2 h再灌注24 h對各組大鼠分別采用Longa評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分。分?jǐn)?shù)越高，損害程度越高。

1.2.4腦梗死體積測定 各組分別取6只大鼠于再灌注24 h后用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后斷頭取腦，將前腦由額極向枕極切成厚度相同的冠狀切片，放入2%TTC溶液中，37℃避光染色30 min，非缺血組織染色后呈紅色，梗死組織呈現(xiàn)白色。用Image J軟件計算腦梗死體積百分比。

1.2.5HE染色檢測病理學(xué)損傷 從剩余的各組大鼠中分別取部分腦組織固定于10%的福爾馬林溶液中，24 h后進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片成4 μm。經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下觀察，細(xì)胞核被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分呈紅色。

1.2.6生化指標(biāo)測定 各組分別取6只大鼠，取出腦組織后于冰上加入生理鹽水制成10%腦勻漿，5 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液。用分光光度法檢測SOD、MDA的活性，ELISA法檢測白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、半胱氨酰白三烯(CysLTs)，方法參照其試劑盒說明書。

1.2.7TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況 從剩余的各組大鼠中分別取部分腦組織石蠟切片，按TUNEL試劑盒操作，最后在顯微鏡下觀察TUNEL陽性染色情況。

1.2.8Western blot檢測組織中Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9的表達(dá)情況 從剩余的各組大鼠中分別取部分腦組織制成腦勻漿后，收集細(xì)胞，提取總蛋白于10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，待蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，在封閉液中封閉60 min后孵育一抗，用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)蛋白，放置于4℃過夜。漂洗后添加二抗，于室溫下孵育1 h，在ECL化學(xué)發(fā)光液中顯色曝光，用Image J處理圖像并計算蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積的影響 如表1所示，從大鼠神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果來看，假手術(shù)組評分最低，損害最小。CI/R組評分最高，受到的損害最大。尼莫地平組(陽性對照)的評分僅低于假手術(shù)組，損害得到顯著修復(fù)。與CI/R組相比，隨著香葉木素劑量的升高，其神經(jīng)功能缺陷評分逐漸降低。與此同時，假手術(shù)組腦梗死體積為0，CI/R組最大，隨著香葉木素劑量的升高，其腦梗死體積逐漸減少，表明香葉木素與尼莫地平有相似的作用和功效，它們對腦缺血再灌注損傷大鼠都有保護(hù)作用，而且具有劑量依賴性。

2.2香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織損傷的影響 如圖1所示，用HE染色檢測不同處理下大鼠腦組織損傷情況，發(fā)現(xiàn)相對于假手術(shù)組，CI/R組大鼠腦組織被染色后呈藍(lán)色的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯增多，損傷加重。而相對于CI/R組，用陽性對照尼莫地平和不同劑量的香葉木素處理后的缺血再灌注損傷大鼠腦組織內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量都相對減少，其中尼莫地平組的效果最為明顯，香葉木素處理組隨著香葉木素劑量的增加，炎癥細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，損傷減輕。因此說明香葉木素可減輕缺血再灌注損傷大鼠的組織損傷。

2.3香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中SOD和MDA活性的影響 如表2所示，與假手術(shù)組相比，CI/R組大鼠腦組織中SOD活性明顯降低，MDA活性顯著升高。與CI/R組相比，香葉木素低、中、高劑量組以及尼莫地平組大鼠腦組織中SOD活性逐漸升高，MDA活性逐漸降低，0.5 mg/kg和1 mg/kg香葉木素組都具有顯著差異性。1 mg/kg香葉木素組SOD和MDA活性幾乎達(dá)到尼莫地平組的水平。表明香葉木素可增加缺血再灌注損傷大鼠腦組織中SOD活性，降低MDA活性。

表1 香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分

Tab.1 Effect of diosmetin on neurological deficits score of CI/R rats

GroupsDose(mg/kg)ScoreCerebral infarctionvolume (%)Sham00.16±0.12-CI/R05.19±0.381)32.57±3.171)Nimodipine61.02±0.063)7.66±1.623)Diosmetin0.254.02±0.2728.45±4.08Diosmetin0.53.36±0.312)20.22±3.312)Diosmetin11.79±0.193)9.16±1.773)

Note：n=6,1)P<0.01,2)P<0.05 versus Sham group;3)P<0.05 versus CI/R group.

圖1 香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織損傷的影響Fig.1 Effect of diosmetin on brain tissue damage in CI/R rats

2.4香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 使用TUNEL檢測不同處理下大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)相比于假手術(shù)組，CI/R組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。而相對于CI/R組，陽性對照組(尼莫地平組)缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細(xì)胞顯著減少，隨著香葉木素濃度的升高，其處理后的大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞也呈逐漸減少的趨勢(圖2)。

之后，對各處理組大鼠腦組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白(Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)相對于假手術(shù)組，CI/R組大鼠腦組織中Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9的表達(dá)量都顯著升高，細(xì)胞凋亡程度較高。相對于CI/R組，尼莫地平組的大鼠腦組織中Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9的表達(dá)量顯著降低。用不同劑量的香葉木素處理后，缺血再灌注損傷大鼠腦組織內(nèi)的這兩種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量都有不同程度的降低，香葉木素(1 mg/kg)組的差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)(圖3)。綜上說明香葉木素可有效抑制缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表2 香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中SOD和MDA活性的影響

Tab.2 Effect of diosmetin on activity of SOD and MDA in brain tissue of CI/R rats

GroupsDose(mg/kg)SOD (U/mg/prot)MDA(U/mg/prot)Sham0100.28±6.592.72±0.83CI/R0 70.55±8.371)6.17±1.041)Nimodipine6 95.16±10.192)3.20±0.762)Diosmetin0.2573.32±7.585.62±1.22Diosmetin0.5 82.36±9.072)4.86±0.972)Diosmetin1 93.29±12.262)3.38±1.062)

Note：n=6,1)P<0.01 versus Sham group;2)P<0.05 versus CI/R group.

圖2 TUNEL檢測香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of diosmetin on cell apoptosis of brain tissue in CI/R rats

表3 香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥因子和CysLTs含量的影響

Tab.3 Effect of diosmetin on inflammatory factor and CysLTs levels in brain tissue of CI/R rats

GroupsDose(mg/kg)IL-1β(pg/ml)TNF-α(ng/ml)CysLTs(ng/mg)Sham0120.55±11.371.35±0.663 269±437CI/R0216.42±15.081)2.07±0.371)7 015±3892)Nimodipine6130.47±17.331.39±0.523 946±510Diosmetin0.25196.58±21.431.92±0.476 537±592Diosmetin0.5172.36±16.713)1.71±0.823)5 201±6134)Diosmetin1138.25±13.853)1.42±0.553)4 152±5774)

Note：n=6,1)P<0.05,2)P<0.01 versus Sham group；3)P<0.05,4)P<0.01 versus CI/R group.

圖3 Western blot檢測香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Western blot for detecting effect of diosmetin on apoptotic related protein expressions in brain tissue of CI/R ratsNote:n=6,*.P<0.05 versus Sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus CI/R group.

2.5香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥因子和CysLTs含量的影響 如表3所示，與假手術(shù)組相比，CI/R組大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α含量明顯升高，CysLTs的含量也顯著升高。相對于CI/R組，香葉木素低、中、高劑量組以及尼莫地平組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α以及CysLTs的含量都表現(xiàn)為明顯下調(diào)，中、高劑量香葉木素組下調(diào)更為顯著。表明香葉木素可有效降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎癥因子和CysLTs的含量。

3 討論

腦缺血再灌注損傷(CI/R)因其危害嚴(yán)重、高發(fā)病率、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜以及目前尚無特效藥物的治療而廣受關(guān)注。近幾年來，藥物預(yù)處理是防治腦缺血再灌注損傷的一個新的研究方向，期望能通過藥物來阻斷神經(jīng)元組織損傷的病理過程，從而對其產(chǎn)生保護(hù)作用[16]。腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制中一個重要的原因就是損傷后會引發(fā)腦細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基或清除能力降低以及炎癥的級聯(lián)反應(yīng)[17]。SOD的活性可直接反映機(jī)體內(nèi)氧自由基的多少。自由基攻擊不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)會產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，MDA就是產(chǎn)物之一，它的多少可反映機(jī)體自由基的水平以及細(xì)胞受到損傷的程度[4]。IL-1β、TNF-α、CysLTs在炎癥反應(yīng)中扮演著重要的角色，尤其是腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)加重時它們的表達(dá)量會升高，并聚集在缺血組織附近，黏附白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，影響血液供應(yīng)，使血漿在管壁聚集，管壁厚度增加，通道變窄，從而導(dǎo)致腦梗死[5-7,18]。已有研究表明當(dāng)歸多糖可通過降低大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷，因此其他具有抗氧化及炎癥能力的藥物可能具有同樣的作用[19]。香葉木素具有很好的藥用價值，它對小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷具有保護(hù)作用[20]，它能通過減少DNA損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)以保護(hù)視網(wǎng)膜受到損傷[21]。表明香葉木素具有抗氧化應(yīng)激和抗炎癥的作用，很可能在腦缺血再灌注損傷中通過這一作用機(jī)制保護(hù)腦組織。那么在本研究中我們主要關(guān)注的是香葉木素處理后腦缺血再灌注損傷大鼠行為、腦梗死體積、腦組織損傷程度、腦組織中凋亡相關(guān)蛋白、SOD、MDA、IL-1β、TNF-α以及CysLTs含量的變化，進(jìn)而來評價香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用。

從實驗結(jié)果來看，相對于CI/R組，香葉木素處理后的腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積降低、腦組織損傷得以減輕、SOD活性升高、MDA活性降低、凋亡細(xì)胞數(shù)量減少、促凋亡相關(guān)蛋白(Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9)表達(dá)量降低，炎癥因子IL-1β、TNF-α以及CysLTs含量降低。表明香葉木素能減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死的發(fā)生，能減弱大鼠腦組織受到的損傷，能提升其腦組織清除氧自由基的能力以減少腦組織內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，能減少其腦組織內(nèi)自由基與質(zhì)膜不飽和脂肪酸發(fā)生的過氧化反應(yīng)，能抑制腦組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，能降低腦組織內(nèi)炎癥因子的含量，從而說明香葉木素對缺血再灌注損傷大鼠具有很好的保護(hù)作用，可能的機(jī)制是抗氧化、抑制凋亡和抗炎癥，這有可能是腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制研究中的一個新發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)報道了一些中草藥物質(zhì)對于腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。如川芎油能降低缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評分，減少腦梗死體積，降低鼠腦組織中MDA含量[4]。蕎麥黃酮能降低腦組織內(nèi)IL-1β、TNF-α水平[6]；黃芩苷和梔子苷配伍可降低腦組織中CysLTs含量[7]，與本研究結(jié)果是一致的。那么香葉木素也是一種防治缺血再灌注損傷的有效藥物。

另外有研究稱，對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控線粒體能量代謝和MAPK/ERK信號通路進(jìn)而抑制腦細(xì)胞凋亡[22]。那么香葉木素是通過什么樣的機(jī)制來對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的呢，還有待進(jìn)一步的研究與探索。