邵 鑫 袁葉雙 蔣先虹 賈艾敏 劉 靜 陳 勇 劉 福

(川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，南充 637000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，致病率和致殘率均較高[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)比例失衡和功能改變與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，RA-FLS是一種類似于腫瘤細(xì)胞樣增殖的細(xì)胞，無接觸性抑制，胞內(nèi)抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，RA-FLS活性增強(qiáng)、凋亡減少是導(dǎo)致RA患者滑膜異常增生的關(guān)鍵原因[2]。自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，并依賴溶酶體降解胞質(zhì)細(xì)胞器和大分子的途徑，對維持細(xì)胞內(nèi)平衡有至關(guān)重要的意義[3]。通常情況下,自噬是在應(yīng)激條件下促進(jìn)細(xì)胞存活的一種調(diào)節(jié)方式，但過度激活自噬會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。由于RA-FLS細(xì)胞凋亡和自噬異常均可導(dǎo)致RA疾病的發(fā)生及進(jìn)展，因此研究藥物對RA-FLS的影響成為治療RA的有效方案。烏頭是一種傳統(tǒng)的中草藥，在中國已有兩千多年的歷史，是一種解熱、鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕藥。烏頭堿是烏頭的主要活性成分之一[6]，已有研究表明適量的烏頭堿可抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]，并可誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[8,9]。最近的證據(jù)表明，烏頭堿具有免疫調(diào)節(jié)特性，可能是治療自身免疫性疾病的潛在有效藥物[10]。本研究通過烏頭堿作用于原代培養(yǎng)細(xì)胞RA-FLS，觀察烏頭堿對細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探究能否誘導(dǎo)自噬，其誘導(dǎo)的自噬又是否為抑制RA-FLS增殖、促進(jìn)RA-FLS凋亡的影響因素。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌器(日本Sanyo公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)；超微量紫外分光光度計(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.2主要藥品與試劑 烏頭堿(Aconitine，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-18110905，純度：98.01%)；胎牛血清、胰酶、二甲亞砜(DMSO)(美國Gibco公司)；MTT試劑(上海碧云天生物科技有限公司)；LC3、β-actin引物(生工生物工程上海股份有限公司)；AnnexinV/PI雙染試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國thermo fisher公司)；兔抗人LC3單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(成都ZenBioScience公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(成都ZenBioScience公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(合肥市Biosharp生物公司)；4%多聚甲醛(合肥市Biosharp公司)；Ⅱ型膠原酶、皂素(美國Sigma公司)；BSA(德國Biofroxx公司)；山羊血清封閉劑、DAPI染劑、抗熒光淬滅劑(上海碧云天生物科技有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(成都ZenBioScience公司)。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng) RA-FLS采用原代細(xì)胞培養(yǎng)[11]。從川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者(n=3)的膝關(guān)節(jié)獲得人滑膜組織標(biāo)本，將滑膜組織用含有2%青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，并剔除血污和脂肪至洗滌液明亮。將組織用無菌剪剪成1 mm×1 mm×1 mm體積的小塊，加入3倍體積4 mg/ml的Ⅱ型膠原酶，放入37℃孵箱中消化4 h，每半小時振蕩數(shù)次。溫育后，用PBS稀釋消化液并用200目無菌篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min，5 min離心后懸浮在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。取第3代至第7代較純的RA-FLS用于本實驗研究。

1.2.2烏頭堿對RA-FLS增殖活力的影響 采用MTT法[12]檢測檢測烏頭堿對RA-FLS增殖活力的影響。實驗分組：空白組(未加細(xì)胞組)、對照組(未加藥組)、烏頭堿230 μmol/L組、烏頭堿460 μmol/L組，烏頭堿用DMSO配制成母液凍于-20℃，待用時用培養(yǎng)基配制成所需濃度，對照組加入等量DMSO。取對數(shù)生長期細(xì)胞，完全培養(yǎng)基調(diào)整密度至5×104個/ml，接種100 μl于96孔板，另設(shè)空白組，加入等體積完全培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁成形后棄去原培養(yǎng)基，加入含烏頭堿的終濃度分別為0(對照組)、230、460 μmol/L的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μl；孵育24 h后每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，置孵箱中繼續(xù)孵育4 h后小心棄去全部液體，加入150 μl的DMSO溶液，避光溶解10 min后采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各孔吸光度(OD)。細(xì)胞增殖活力(%)=[1-(對照組細(xì)胞OD值-給藥組細(xì)胞OD值)/(對照組細(xì)胞OD值-空白組OD值)]×100%。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。

1.2.3烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)[13]檢測烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率約為80%時棄去原培養(yǎng)液，加入含烏頭堿的終濃度分別為0、230、460 μmol/L的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)24后，收集各組細(xì)胞，再以PBS 500 μl重懸細(xì)胞，先后加入AnnexinV-FITC、PI染色試劑各5 μl，混勻，在冰上避光孵育15 min，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。采用FlowJo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理。

1.2.4烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞中LC3 mRNA水平相對表達(dá)的影響 采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法[14]檢測烏頭堿對RA-FLS中LC3 mRNA水平相對表達(dá)的影響。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入相應(yīng)終質(zhì)量濃度的含烏頭堿分別為0、230、460 μmol/L的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml，培養(yǎng)24 h。TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA后，采用紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，采用RT-qPCR儀檢測β-actin、LC3基因的表達(dá)水平。總反應(yīng)體積為10 μl。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 30 s；95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)20 s，40個循環(huán)。LC3的正義鏈序列為AATCCCGGTGATCATCGAGC，反義鏈序列為GCCGGATGATCTTGACCAAC(5′-3)； β-actin的正義鏈序列為AGCACTGTGTTGGCGT-ACAG，反義鏈序列為TCCCTGGAGAAGAGCTACGA(5′-3′)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)水平。

1.2.5烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞中LC3蛋白相對表達(dá)的影響 采用Western blot法[15]檢測烏頭堿對RA-FLS中LC3蛋白相對表達(dá)的影響。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加藥處理(與1.2.4相同)。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，在90℃金屬浴條件下使蛋白變性10 min，于-20℃保存，待用。使用時分別取變性蛋白樣品25 μg，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉，封閉，β-actin、LC3一抗(1∶1 000) 4℃孵育過夜；次日二抗(1∶10 000)孵育，然后在凝膠成像儀中采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。采用Image J 1.52a 軟件對蛋白條帶進(jìn)行圖像分析，計算蛋白相對灰度值。

1.2.6免疫熒光 采用免疫熒光觀察細(xì)胞自噬[16]。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于鋪有載玻片的6孔板中，加入相應(yīng)終質(zhì)量濃度的含烏頭堿分別為0、230、460 μmol/L的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml，此外，另設(shè)雷帕霉素(Rapamycin)陽性對照組(50 nmol/L)，培養(yǎng)24 h后，依次進(jìn)行以下步驟：用4%多聚甲醛溶液室溫固定 15 min；PBS洗滌2次后，用含有0.1% 皂素的 PBS 通透細(xì)胞 15 min；PBS洗滌2次后用5%正常山羊血清封閉45 min；加入LC3一抗孵育(兔抗-LC3 1∶100，杭州華安生物科技有限公司)在4℃下過夜，次日用PBS洗滌3次，后在37℃下進(jìn)行二抗(羊抗兔IgG-TRITC，1∶400)避光孵育45 min，后用PBS洗滌3次，然后用DAPI染核5 min，封片，觀察。用激光掃描共聚焦顯微鏡(OILMPUS)進(jìn)行樣品分析。

2 結(jié)果

2.1烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞增殖活力的影響 由圖1可見，與對照組相比，烏頭堿加藥組細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸變圓，胞核色素沉著，細(xì)胞間隙增加。MTT結(jié)果顯示，以對照組細(xì)胞增殖活力為100%計算，烏頭堿230 μmol/L組的細(xì)胞增殖活力為(80.56±4.99)%，烏頭堿460 μmol/L組的細(xì)胞增殖活力為(53.03±2.96)%(見圖2)。

2.2烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響 圖3中，凋亡細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞(右下象限)與晚期凋亡細(xì)胞(右上象限)之和，流式檢測結(jié)果顯示，烏頭堿230 μmol/L組細(xì)胞凋亡率為(15.12±2.87)%，與對照組(11.69±1.36)%相比雖有所增加但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.135)，而烏頭堿460 μmol/L組(26.16±5.68)%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞中LC3 mRNA相對表達(dá)的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，烏頭堿230 μmol/L組LC3 mRNA的相對表達(dá)為(1.655 90±0.456 79)、烏頭堿460 μmol/L組(1.739 20±0.214 51)，均高于對照組 (1.048 70±0.338 34)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

2.4烏頭堿對RA-FLS細(xì)胞中LC3蛋白相對表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，烏頭堿230 μmol/L組LC3/β-actin 蛋白的相對表達(dá)為(0.606 20±0.035 1)、烏頭堿460 μmol/L組(1.062 70±0.154 06)，均高于對照組 (0.247 40±0.032 24)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖5)。

圖3 烏頭堿對RA-FLS凋亡的影響Fig.3 Effect of aconitine on apoptosis of RA-FLSNote:Cell apoptosis was determined by flow cytometry.*.P<0.05 vs control group(Aconitine=0 μmol/L).

圖4 烏頭堿對LC3/β-actin mRNA相對表達(dá)的影響Fig.4 Effect of aconitine on relative expression of LC3/β-actin mRNANote:The mRNA levels was determined by RT-qPCR.*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group(Aconitine=0 μmol/L).

2.5免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白 采用綠色熒光標(biāo)記自噬蛋白LC3，綠色斑點代表自噬體的形成。圖中共聚焦結(jié)果顯示，未加藥對照組中綠色熒光呈彌散狀分布于細(xì)胞中，雷帕霉素陽性組中綠色熒光成斑點狀出現(xiàn)在細(xì)胞中。烏頭堿組綠色熒光顯著，且出現(xiàn)綠色斑點，尤以烏頭堿460 μmol/L組最為明顯，提示細(xì)胞膜上自噬體形成，細(xì)胞自噬水平升高，烏頭堿可使RA-FLS中的自噬活化(見圖6)。

圖5 烏頭堿對LC3/β-actin蛋白相對表達(dá)的影響Fig.5 Effect of aconitine on relative expression of LC3/β-actin proteinNote:The protein levels was determined by Western blot.β-actin was used as loading control.**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group(Aconitine=0 μmol/L).

圖6 共聚焦結(jié)果圖Fig.6 Confocal results

3 討論

RA的病理學(xué)特征是滑膜的炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的慢性炎癥和進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷[17]，RA-FLS釋放大量致炎因子介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)破壞，且具有類似腫瘤樣細(xì)胞生長的特性，在具有侵襲性表型的RA發(fā)病機(jī)理中起重要作用[18,19]，抑制RA-FLS的異常增殖對RA的治療具有重要作用。在本研究中，我們初步發(fā)現(xiàn)烏頭堿能有效抑制RA-FLS的增殖活性，且隨著烏頭堿劑量增加細(xì)胞增殖活性百分率也逐漸降低。

目前LC3蛋白是檢測細(xì)胞自噬的常用指標(biāo)[20]，自噬是一種保守的遺傳調(diào)控途徑，它可以分解代謝錯誤折疊的蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器等細(xì)胞內(nèi)容物，其具體過程為通過雙層膜結(jié)構(gòu)包裹蛋白或細(xì)胞器后形成自噬小泡，在溶酶體內(nèi)完成降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[21,22]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈(Microtubulesas sociated protein1 light chain，LC3)是酵母菌Atg8基因的同源產(chǎn)物，LC3在 Atg4蛋白酶的作用下裂解生成LC3 I[23]。當(dāng)發(fā)生自噬現(xiàn)象時，經(jīng)泛素樣加工修飾催化的LC3Ⅰ與自噬小體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3Ⅱ[24]。LC3Ⅱ是自噬過程中十分重要的信號分子，同時也是自噬發(fā)生的標(biāo)記性蛋白[25]。LC3Ⅱ與自噬小體膜緊密結(jié)合，存在于自噬小體膜上，因此通過檢測LC3Ⅱ水平的高低可以監(jiān)測自噬的發(fā)生以及判斷其活性的強(qiáng)弱[26,27]。在本研究中，通過RT-qPCR表明烏頭堿230 μmol/L組及460 μmol/L 組中RA-FLS的LC3相對基因表達(dá)水平高于對照組，隨后，驗證烏頭堿加藥組同樣增強(qiáng)LC3相對蛋白的表達(dá)水平，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這些結(jié)果說明烏頭堿能有效誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞中自噬水平，呈濃度依賴性。此外，通過免疫熒光檢測LC3自噬體的形成，雷帕霉素陽性組中綠色熒光成斑點狀聚集在細(xì)胞中，與未加藥對照組相比，烏頭堿加藥組中綠色熒光明顯增強(qiáng)，LC3Ⅱ成斑點狀聚集于細(xì)胞中，同樣也證實烏頭堿組可誘導(dǎo)RA-FLS的自噬水平。自噬對細(xì)胞具有雙重作用，當(dāng)自噬過度激活時，細(xì)胞發(fā)生裂解，引起自噬性細(xì)胞死亡[28]；而當(dāng)自噬適度激活時，可加速胞內(nèi)損傷蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的降解，產(chǎn)生氨基酸等小分子，供給物質(zhì)及能量需要，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活[29]。此前，我們通過流式細(xì)胞術(shù)已檢測出烏頭堿230 μmol/L組及460 μmol/L組均能促進(jìn)RA-FLS凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著烏頭堿劑量增加細(xì)胞凋亡百分率也增加，說明烏頭堿能誘導(dǎo)RA-FLS發(fā)生凋亡并具有濃度依賴性。以上結(jié)果表示，烏頭堿促進(jìn)RA-FLS細(xì)胞凋亡可能與其過度激活LC3基因及蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬體的產(chǎn)生有關(guān)。

綜上，烏頭堿可有效抑制RA-FLS的增殖活性并誘導(dǎo)凋亡，且具有濃度依賴性，這可能與其過度激活RA-FLS中的自噬水平有關(guān)。