孫紅婷 宋艷榮

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110024)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床癥狀主要是認知和記憶功能障礙，同時伴有精神和行為障礙。AD的病理特征包括β-淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積、tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、突觸神經(jīng)元丟失、氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥等[1]。在過去的幾年中，上市的治療藥物只能緩解癥狀，并不能從根本上延緩AD的發(fā)病進程。因此，尋求新的AD治療藥物及靶點已經(jīng)成為全世界醫(yī)學專家亟待解決的問題[2]。

從中國傳統(tǒng)醫(yī)學角度看，AD發(fā)病的根本原因是腎精虧虛，髓海不足。中醫(yī)學認為“腎主智，腎虛則智不足”，“腎藏精，主骨生髓”，“腦為髓之海”，腦髓的充養(yǎng)與腎精的充盈密切相關(guān)，同時AD是與髓減腦消關(guān)系最為密切的疾病之一，因此大多中醫(yī)學者多以補腎填精、益氣養(yǎng)血等作為治療AD的基本法則[3]。楮實子(Fructus broussonetiae,FB)味甘性寒，歸肝腎經(jīng)，功效為補腎清肝，明目，利尿；主治肝腎不足，腰膝酸軟，虛勞骨蒸，頭暈目昏[4]。有研究表明，楮實子能通過促進APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生發(fā)揮神經(jīng)保護作用[5]。此外，楮實子提取物能夠通過調(diào)節(jié)p38-MAPK信號通路活性來改善D-半乳糖所致的PC12細胞凋亡[6]。但是對Aβ沉積及學習記憶能力的改善及其作用機制尚未見報道。

cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)啟動子中含有環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件(CRE)的基因轉(zhuǎn)錄，CREB在神經(jīng)發(fā)生、突觸形成及改善學習記憶能力方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Protein-serine-threonine kinase,Akt)信號通路與細胞生長、增殖、遷移及凋亡等過程均密切相關(guān)。PI3K磷酸化后被激活，可正性調(diào)節(jié)CREB，使其磷酸化并連接到相應(yīng)的啟動子區(qū)，誘導cAMP反應(yīng)原件基因表達[8]。因此，本研究探討楮實子提取物對APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ沉積、學習記憶能力及對PI3K-CREB-XBP1信號通路活性的影響，為治療AD等神經(jīng)退行性疾病開發(fā)新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與試劑 SPF級C57BL/6雄性小鼠，購于遼寧長生生物有限公司[SCXK(遼)：2013-0001]，7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠購自北京中科澤晟生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2013-0001]，體重(20±2)g，楮實子購自安徽亳州藥材市場，鹽酸多奈哌齊(Sigma公司)，鼠來源Aβ1-42抗體(Santa Cruze公司)，鼠來源Iba-1抗體(Abcam公司)，兔來源GFAP及GAPDH抗體(北京博奧森)，兔BACE1、ADAM10、PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s及XBP1u抗體購于CST公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購于北京中杉金橋科技有限公司，羊抗小鼠FITC標記二抗、驢抗兔Cy3標記二抗(Jackson公司)，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器 石蠟切片機(德國萊卡公司)，熒光倒置顯微鏡、照相系統(tǒng)(日本尼康公司)，MS-1水迷宮儀(成都儀器廠)，酶標儀(深圳邁瑞公司)，半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 將7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機模型組(model)、楮實子低劑量組(2 g/kg,FB-L)、楮實子高劑量組(4 g/kg,FB-H)和陽性藥組(10 mg/kg鹽酸多奈哌齊,DH)，每組10只；另取10只同齡的C57BL/6小鼠作為對照組(control)。

1.2.2藥材準備 取適量楮實子藥材，置于10倍量蒸餾水中浸泡2 h后進行煎煮，共2次，每次2 h，回收藥液并合并，濃縮藥液至生藥濃度為1 g/ml，對小鼠進行灌胃給藥，陽性藥組用10 mg/kg多奈哌齊灌胃給藥，對照組給予同體積的蒸餾水，連續(xù)治療8周。最后一次給藥1 h后處死小鼠，取腦、一部分腦組織包埋，制備石蠟切片，另一部分置于-80℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.2.3水迷宮實驗 各組小鼠治療7周后，Morris水迷宮用于評估小鼠的學習和記憶能力。該裝置由一個圓形池(直徑120 cm，高60 cm)和黑色內(nèi)壁組成，黑色內(nèi)壁細分為四個相等的象限，并用水(25℃)填充至30 cm的深度。將逃逸平臺(直徑10 cm)放置在其中一個象限內(nèi)并浸沒在水面下約1 cm 處。連續(xù)5 d分別從四個象限中觀察小鼠的逃避潛伏期。如果小鼠在60 s內(nèi)無法到達平臺，則將它們引導至平臺并停留10 s。訓練5 d后，移除平臺并進行空間探索實驗，將各組小鼠從同一入水點放入水中，觀察其穿越原平臺的次數(shù)以及在原平臺所在象限停留的時間。

1.2.4免疫熒光染色 腦組織制備石蠟切片，厚為5 μm，組織切片常規(guī)脫蠟之后，將組織切片放入枸櫞酸緩沖溶液中，利用微波法進行抗原修復，微波爐加熱沸騰5 min×3次；滴加3 % H2O2溶液5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；分別加入GFAP、Iba-1或Aβ1-42一抗(1∶300)，4℃孵育過夜，次日加入羊抗小鼠FITC標記二抗或驢抗兔Cy3標記二抗(1∶500)室溫避光孵育1 h；DAPI染核15 min，蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下觀察陽性細胞表達情況。

1.2.5Western blot 剝離各組小鼠海馬組織，置于RIPA裂解液中研磨，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，分別進行電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，測定光密度。Aβ1-42、BACE1、ADAM10、PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s、XBP1u及GAPDH抗體稀釋濃度均為1∶1 000，HRP標記二抗稀釋濃度為1∶1 000。采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1楮實子提取物對APP/PS1小鼠的學習與記憶能力的影響 Morris水迷宮結(jié)果如圖1所示，逃避潛伏期結(jié)果(圖1A、B)顯示，經(jīng)過5 d的定位航行訓練，對照組逃避潛伏期最短，與對照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；楮實子低、高劑量及陽性藥組小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；楮實子高劑量與陽性藥組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？臻g探索實驗結(jié)果(圖1C、D)顯示，與對照組相比，模型組小鼠在原平臺目標象限停留時間顯著縮短、穿越原平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)，楮實子低、高劑量及陽性藥組小鼠在原平臺目標象限停留時間及穿越平臺次數(shù)顯著增加，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且楮實子低劑量與陽性藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 FB對APP/PS1小鼠學習和記憶的影響Fig.1 Effect of FB on learning and memory in APP/PS1 miceNote:A.The escape latency in the formal experiments of the water maze task;B.Target quadrant residence time;C.The number of times the platform location was crossed.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group;&.P<0.05 vs DH group.

2.2楮實子對星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞異?；罨挠绊?楮實子對星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞異?；罨挠绊懡Y(jié)果如圖2所示，對照組小鼠海馬區(qū)GFAP及Iba-1陽性細胞表達較少；模型組小鼠海馬區(qū)GFAP及Iba-1陽性表達明顯增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，楮實子低、高劑量及陽性藥組小鼠海馬區(qū)GFAP及Iba-1陽性表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且楮實子高劑量與陽性藥組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 FB對APP/PS1小鼠海馬中GFAP和Iba-1表達的影響(×200)Fig.2 Effect of FB on expression of GFAP and Iba-1 in hippocampal of APP/PS1 mice(×200)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group;&.P<0.05 vs FB-L group.

圖3 FB對APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-42沉積的影響Fig.3 Effect of FB on Aβ1-42 deposition in hippocampal of APP/PS1 miceNote:A.Representative images of Aβ plaque by immunofluorescence staining (×200)；B.The representative bands of proteins of Aβ1-42.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

圖4 FB對APP/PS1小鼠海馬中ADAM10和BACE1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of FB on ADAM10 and BACE1 protein expression in hippocampal of APP/PS1 miceNote:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

2.3楮實子對Aβ1-42斑塊沉積的影響 免疫熒光結(jié)果(圖3A)顯示，對照組小鼠海馬區(qū)未見Aβ1-42斑塊沉積，而模型組小鼠海馬區(qū)可見大量的Aβ1-42斑塊沉積，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；楮實子低、高劑量及陽性藥物治療后，小鼠海馬區(qū)Aβ1-42沉積明顯減少，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。為了進一步驗證楮實子對Aβ1-42沉積的影響，利用Western blot檢測了小鼠海馬區(qū)Aβ1-42蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楮實子低、高劑量及陽性藥組Aβ1-42蛋白表達明顯降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3B)，與免疫熒光結(jié)果一致。

2.4楮實子對ADAM10及BACE1蛋白表達 結(jié)果如圖4所示，對照組小鼠ADAM10蛋白高表達，而BACE1蛋白低表達；模型組小鼠海馬組織ADAM10蛋白水平明顯降低，而BACE1蛋白水平顯著升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；楮實子低、高劑量及陽性藥組ADAM10蛋白水平明顯增加，而BACE1蛋白水平顯著降低，與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且楮實子高劑量與陽性藥組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5楮實子對PI3K-CREB-XBP1信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白比值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 而楮實子低、高劑量及陽性藥物能夠明顯提高p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白比值，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且楮實子高劑量與陽性藥組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖5 FB對APP/PS1小鼠海馬中p-PI3K，PI3K，p-CREB，CREB，XBP1s和XBP1u蛋白表達的影響Fig.5 Effect of FB on p-PI3K,PI3K,p-CREB,CREB,XBP1s and XBP1u proteins expression in hippocampal of APP/PS1 miceNote:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs model group.

3 討論

AD是全世界老齡化人群中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。神經(jīng)元外Aβ沉積形成的老年斑和由于tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是其兩大病理學特征，其中Aβ級聯(lián)假說是研究最為廣泛的[9]。Aβ沉積后具有神經(jīng)毒性，能與腦內(nèi)受體酪氨酸激酶EphB2、晚期糖化終產(chǎn)物受體RAGE等多種細胞表面分子結(jié)合，激活細胞間的信號傳遞，進而引起細胞氧化應(yīng)激、細胞內(nèi)鈣紊亂、線粒體功能障礙、抑制海馬神經(jīng)元長時程增強、誘導神經(jīng)元凋亡，參與了AD的病理形成，最終導致記憶減退、認知障礙和人格改變[10]。

《日華子本草》 中記載：楮實子具有“壯筋骨、助陽氣、補虛勞、助腰膝、益顏色”之功效。 現(xiàn)代藥理學研究表明楮實子提取液具有改善學習記憶能力、增強免疫力、降血脂、抗氧化及抗腫瘤等作用。楮實子化學成分復雜，主要化學成分包括總皂苷、黃酮、生物堿、脂肪油、紅色素、多糖以及多種人體必需且具有重要藥理活性的微量元素和氨基酸等。其中，總皂苷是楮實子藥理活性的中藥成分之一[11]。楮實子水提液能明顯改善老年小鼠的學習與記憶能力，可明顯縮短小鼠走迷宮取食時間及減少錯誤次數(shù)；還能夠通過抑制小鼠海馬區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平來改善AD模型小鼠的學習與記憶能力。楮實子提取物還能夠提高腦內(nèi)超氧化物歧化酶活性降低AD模型氧化應(yīng)激水平，從而改善腦內(nèi)微環(huán)境[12]。并且何堃等[4]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選的方法從楮實子中篩選出60個化合物，如棕櫚酸、油酸、8，11-十八碳二烯酸等;還有黃酮類如木犀草素、芹菜素;還有香豆素類如東莨菪素、香豆酸以及δ-生育酚等。這些活性成分可與AD有關(guān)的27個潛在靶點存在較強的聯(lián)系，以及4條相關(guān)信號通路，包括細胞凋亡、能量代謝、鈣信號通路、腫瘤壞死因子(TNF) 信號通路、胰島素抵抗等[13]。以上研究說明楮實子具有多靶點、多途徑、多層次治療AD的特點。

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型目前是世界上公認的AD動物模型之一，可表達突變的人類早老素基因(第九個外顯子突變)和人鼠淀粉樣前體蛋白融合體，其中人類早老素基因的第九個外顯子突變?nèi)笔菍е略绨l(fā)性老年癡呆癥發(fā)生的關(guān)鍵原因[14]。大腦海馬區(qū)是AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)最易受到損害的區(qū)域之一，負責學習和記憶功能的維持。由于AD患者海馬神經(jīng)元外可沉積大量老年斑及神經(jīng)纖維纏結(jié)，因此AD患者在患病早期即會出現(xiàn)學習與記憶障礙[15]。Morris水迷宮是一種評價空間辨別性學習記憶能力的實驗手段，是評價嚙齒類動物空間學習記憶功能的經(jīng)典方法[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予楮實子提取物連續(xù)治療8周后小鼠逃避潛伏期縮短，表明獲取空間信息記憶的能力有所改善；同時小鼠穿越原平臺次數(shù)增多，原平臺象限停留時間延長，表明楮實子提取物改善了APP/PS1小鼠對獲取的空間信息的記憶儲存及再現(xiàn)能力。

Aβ的大量沉積可活化星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，釋放炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生大量炎癥因子及其他神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而造成神經(jīng)元損傷[17]。GFAP和Iba-1分別為星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的特異性蛋白，其陽性細胞表達增多即可反映出星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化程度[18]。本研究利用免疫熒光染色法檢測小鼠海馬GFAP和Iba-1的表達情況，結(jié)果顯示，楮實子提取物能夠明顯減少小鼠海馬GFAP和Iba-1的陽性細胞數(shù)量，說明楮實子可以抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的異常活化，減輕APP/PS1小鼠神經(jīng)損傷。同時，免疫熒光染色及Western blot結(jié)果顯示楮實子低、高劑量組APP/PS1小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ1-42沉積明顯改善，說明楮實子改善小鼠學習與記憶能力，并抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化與改善神經(jīng)元外Aβ1-42沉積有關(guān)。

機體存在兩種淀粉樣前體蛋白APP(Amyloid precursor protein,APP)水解途徑，分別為淀粉樣水解途徑和非淀粉樣水解途徑。其中，非淀粉樣水解途徑是APP經(jīng)α分泌酶(ADAM10)酶切后形成的可溶性Aβ片段，所產(chǎn)生的可溶性Aβ片段不具有神經(jīng)毒性；而淀粉樣水解途徑是APP經(jīng)β分泌酶(BACE1)酶切后形成C99片段，隨后再由γ分泌酶進行酶切，生成可溶性的Aβ1-40或不可溶性的Aβ1-42，普遍認為Aβ1-42的異常生成是導致老年斑形成的罪魁禍首[19,20]。本研究為了探討楮實子對Aβ1-42生成途徑相關(guān)酶活力的影響，我們檢測了α分泌酶(ADAM10)及β分泌酶(BACE1)蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楮實子提取物能夠明顯增加ADAM10蛋白表達，而抑制BACE1蛋白表達，說明楮實子能增強APP的非淀粉樣水解，而抑制APP的淀粉樣水解，從而減少了Aβ1-42的沉積。

CREB具有調(diào)節(jié)突觸可塑性和改善長期記憶能力的作用。有研究表明，在AD模型中，CREB和活性降低，但其可以被PI3K/Akt信號通路所激活，發(fā)揮神經(jīng)保護作用；同時，PI3K磷酸化激活后能促進XBP1剪切生成具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白XBP1s，從而使XBP1活性增加；而XBP1是ADAM10的轉(zhuǎn)錄因子之一，ADAM10的活性與XBP1成正比[21-23]。有研究表明，XBP1的活性降低是Aβ1-42斑塊沉積和AD病情加重的原因之一，因此說明PI3K-CREB-XBP1信號通路在AD發(fā)展過程中具有重要作用[24]。我們?yōu)榱颂骄胯鷮嵶右种艫β1-42沉積的作用機制，我們檢測了PI3K-CREB-XBP1信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、CREB、p-CREB、XBP1s及XBP1u蛋白的表達情況沒結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楮實子能夠明顯提高p-PI3K/PI3K、p-CREB/CREB及XBP1s/XBP1u蛋白的表達，提示楮實子抑制Aβ1-42沉積，改善APP/PS1小鼠學習與記憶能力，可能與激活PI3K-CREB-XBP1信號通路有關(guān)。

綜上所述，楮實子提取物能夠改善APP/PS1小鼠改善學習與記憶能力，抑制星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞活化，抑制Aβ1-42沉積的作用機制可能與調(diào)控PI3K-CREB-XBP1信號通路活性有關(guān)，但具體作用機制仍需進一步深入研究。