金 華 張 磊 王億平 呂 勇 王 東 王立媛 章雪蓮 胡 嵐 包婭瓊 高雅晨

(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科，合肥 230031)

慢性腎小球腎炎(Chronic glomerulonephritis，CGN)的主要臨床表現(xiàn)是蛋白尿、血尿、高血壓、水腫；其病程進展緩慢，可伴隨不同程度的腎功能減退的一組腎小球疾病[1]。CGN因其病程長、易反復，加之激素和免疫抑制劑的使用，副作用大且多，療效不一；并且是中國患者終末期腎病的首位病因(約占50%)[2]。一旦進入終末期腎病會給患者及當今社會帶來沉重的醫(yī)療負擔，有效的防治CGN也是中醫(yī)藥防治腎病工作者關注和研究的熱點。前期研究證實，中藥復方參地顆?？梢杂行Ь徑釩GN不同病理類型脾腎虧虛證患者的臨床癥狀、消減尿蛋白[3]，同時對患者的T細胞亞群和外周單個核細胞B7-1介導的免疫紊亂均有一定的調(diào)節(jié)作用[4,5]。

外周血單個核細胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)的沉積與凋亡，是導致自身免疫紊亂[6]及抗原-抗體復合物在腎臟聚集的重要原因[7]。單核細胞趨化蛋白-1(Methylcyclopropene-1，MCP-1)具有趨化并激活外周血單個核細胞的作用。MCP-1在腎臟的高表達中不但能夠激活更多的炎癥細胞浸潤，還能直接刺激腎臟固有細胞分泌更多的促炎癥因子和細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的合成，加重腎小球的炎癥反應[8]。而轉化生長因子-β1(Transformation growth factor-β1，TGF-β1)在促進ECM的蓄積、腎小球硬化中起著重要的調(diào)控作用，當其過度表達時還可導致腎組織纖維化[9]。因此基于PBMC凋亡及MCP-1、TGF-β1的表達，故開展本次觀察研究進一步明確參地顆粒在CGN中的干預作用，為其臨床應用及后續(xù)深入的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 全自動酶標儀(型號：Multiskan MK3，廠家：Thermo scientific)；流式細胞儀(型號：FC 500，廠家：BECKMAN COULTER)；人外周血單個核細胞分離液(型號：LTS1077)購自天津灝洋；Bcl-2抗體(型號：12789-1-AP)、Fas抗體(型號：13098-1-AP)購自Proteintech；MCP-1 ELISA試劑盒(型號：R-EL-R0633c)、TGF-β1 ELISA試劑盒(型號：R-EL-R0084c)購自Elabscience。

1.2研究方法

1.2.1診斷標準 西醫(yī)診斷標準:①慢性腎炎診斷標準：參照王海燕主編的《腎臟病學》[10]。②慢性腎臟病分期標準：參照2012年國際腎臟病組織“腎臟病：改善全球預后”(Kidney disease：improving global outcomes，KDIGO)[11]分期標準。GFR的估算依據(jù)慢性腎臟病流行病學合作研究(CKD-EPI)公式[12]。③中醫(yī)證候-脾腎虧虛證診斷標準：參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[13]中的標準。

1.2.2病例選擇標準 (1)納入標準：①符合西醫(yī)學CGN診斷標準及中醫(yī)脾腎虧虛證候診斷標準；②符合慢性腎臟?、?、Ⅱ期(eGFR>60 ml/min)；③24 h尿蛋白定量小于3 g；④年齡為18～70歲。(2)排除標準：①不符合病例納入標準者；②合并有心、腦疾病或嚴重傳染病者；③正在服用激素、細胞毒藥物者；④妊娠或哺乳期婦女；⑤生活不可自理或患精神疾病，不能按規(guī)定服藥者；⑥資料不全，無法判斷療效者。(3)剔除標準：①受試者依從性差(試驗用藥依從性<80%或>120%)，中途停藥、換藥、加藥，或合并使用本方案禁止的中西藥物；②服用了受試方案外的藥物影響療效和安全性判定。(4)終止標準：①治療過程中出現(xiàn)嚴重的不良事件和合并癥，導致無法繼續(xù)接受治療者；②失訪或自行退出實驗者；③嚴重違反本次實驗方案用藥者。

1.2.3病例收集及分組 本研究為前瞻性隨機對照研究，收集2017年3月至2017年12月在安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科就診的CGN脾腎虧虛證患者，采用隨機數(shù)字表法，治療組和對照組按照(1∶1)分配入組，本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批號：2017AH-04，所有患者簽署知情同意書。同時在中國臨床試驗注冊中心網(wǎng)上注冊-注冊號ChiCTR-INR-17011060。本研究共納入符合標準的患者60例，隨機分為對照組和治療組各30例，治療組有1例患者于外院接受潑尼松治療，對照組有2例于外院接受雷公藤多甙治療，故剔除；最終完成本次實驗的患者者總數(shù)為57例，治療組29例，男16例，女13例，平均年齡(39.02±12.58)歲，平均病程(3.45±1.22)年；對照組28例，男15例，女13例，平均年齡(39.35±11.03)歲，平均病程(3.26±1.35)年；另外從我院體檢中心納入20例健康體檢人員作為正常組，平均年齡(40.33±10.18)歲。三組患者一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2.4干預措施 治療組服用參地顆粒(生產(chǎn)批號：20140418)，由紅參、熟地、五味子、川芎等藥物組成，統(tǒng)一由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院加工制造，每次10 g，每日3次；對照組服用纈沙坦膠囊(諾華制藥)，規(guī)格：80 mg/粒，每日80 mg，療程12周。兩組患者均予以低鹽低脂飲食，積極控制血壓(<140/90 mmHg)。降壓藥物首選鈣通道阻滯劑，若血壓控制不能達標，依次加用β受體阻滯劑、α受體阻滯劑、中樞性降壓藥等。

1.2.5觀察指標 (1)中醫(yī)證候療效，參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[13]，依據(jù)中醫(yī)癥候積分值分為臨床痊愈、顯效、有效、無效。(2)于訪視1至訪視4共檢查4次24 h UPr；常規(guī)生化法檢測Scr及BUN水平，并估算eGFR，于訪視1、訪視4各檢查1次。(3)運用流式細胞儀檢測PBMC凋亡率；Western blot法檢測PBMC凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Fas的表達；ELISA法檢測血清MCP-1、TGF-β1表達水平，分別于訪視1、訪視4各檢查1次。

2 結果

2.1中醫(yī)癥候療效比較 治療組總有效率為93.10%，對照組為67.85%，治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2治療前后24 h尿蛋白定量水平比較 治療前兩組患者24 h尿蛋白定量比較無明顯差異(P>0.05)；治療第8周和第12周兩個時點比較，治療組降低24 h尿蛋白定量的作用優(yōu)于對照組(P<0.05)；治療組的療效與治療時間呈正相關，見表2。

2.3腎功能水平比較 兩組患者治療前后腎功能水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4PBMC凋亡率及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Fas水平比較 CGN患者PBMC凋亡率及Fas表達較正常人群高(P<0.01)；治療后CGN患者的PBMC凋亡率及Fas表達較治療前低(P<0.05)，且治療組低于對照組(P<0.05)。CGN患者PBMC中的Bcl-2表達較正常人群減少(P<0.01)；治療后其表達增加(P<0.05)；且治療組升高水平更高，優(yōu)于對照組(P<0.05)，見表4，圖1。

表1 中醫(yī)證候療效比較

Tab.1 Comparison of therapeutic effects of TCM syndrome

GroupsnClinical recoverMarkedly effectiveEffectiveInvalidTotal effective rate(%)Control group28469967.85%Treatment group298712293.10%

GroupsnBefore treatmentWeek 4Week 8Week 12Control group 281.16±0.311.03±0.302)0.94±0.322)0.79±0.322)Treatment group 291.18±0.241.01±0.251)2)0.90±0.251)2)0.71±0.251)2)

Note：Comparisons with control group，1)P<0.05；comparisons with before treatment，2)P<0.05.

GroupsScr(μmol/L)Before treatmentAfter treatmentBUN( mmol/L)Before treatmentAfter treatmenteGFR(ml/min)Before treatmentAfter treatmentControl group 63.5±3.5560.6±4.315.62±0.545.67±0.5984.31±6.7582.23±7.21Treatment group 62.7±4.2163.4±2.145.70±0.685.24±0.8582.56±6.6182.51±6.39

GroupsnPBMC Apoptotic rate(%)Before treatmentAfter treatmentBcl-2Before treatmentAfter treatmentFasBefore treatmentAfter treatmentNormal group2011.39±1.05-0.21±0.02-0.03±0.006- Control group 2941.36±3.531)32.58±5.242)0.11±0.031)0.14±0.012)0.06±0.0081)0.05±0.0092)Treatment group2841.62±5.371)27.86±6.722)3)0.13±0.031)0.18±0.012)3)0.08±0.0061)0.04±0.0092)3)

Note：Apoptotic rate %=early apoptotic rate %+late apoptotic rate%；Comparisons with normal group，1)P<0.01；comparisons with before treatment，2)P<0.05；comparisons with control group，3)P<0.05.

GroupsnMCP-1Before treatmentAfter treatmentTGFβ-1Before treatmentAfter treatmentNormal group20235.48±10.05-141.54±15.76-Control group 29277.89±9.441)262.14±12.422)211.07±18.701)193.95±28.582)Treatment group28275.61±11.581)253.32±15.512)3)211.12±17.321)171.52±16.522)3)

Note：Comparisons with normal group，1)P<0.05；comparisons with before treatment,2)P<0.05;comparisons with control group,3)P<0.05.

圖1 PBMC細胞表達流式圖Fig.1 PBMC cell expression flow chart

2.5血清MCP-1、TGF-β1表達水平比較 CGN患者血清MCP-1、TGF-β1的表達較正常人增多(P<0.05)；治療后患者MCP-1、TGF-β1水平下降(P<0.05)，且治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)，見表5。

3 討論

慢性腎炎按其臨床證候表現(xiàn)不同，可歸屬于“慢腎風”、“尿濁”、“水腫”、“虛勞”等范疇。慢性腎炎的病因病機歷代各醫(yī)家觀點各有不同，但均認為其本在于脾腎虧虛這一病機。課題組長期致力于中醫(yī)藥防治腎臟疾病的基礎與臨床，并且總結出了該病的基本病機乃脾腎虧虛為本，濕熱、瘀血為標[14]。基于這一病機，采用出自清朝新安醫(yī)學名醫(yī)程林刪定的《圣濟總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯加減治療CGN[15]，在取得臨床療效后，進一步總結出參地顆粒，方中人參補脾益肺、益腎助陽，固攝精微為君；茯苓、熟地健脾益腎，五味子養(yǎng)陰固精，桑螵蛸固精縮尿，雞內(nèi)金攝精止遺，共為臣藥；川芎活血化瘀，為佐使之用，全方共奏健脾益腎、固攝精微之功，又兼顧化瘀之法。前期臨床觀察研究證實參地顆粒對于脾腎虧虛證CGN不僅有良好的臨床療效，同時對患者的異常免疫炎癥狀態(tài)有一定的糾正作用[3-5,16,17]，本次研究再次證實了參地顆粒的臨床療效同時也展現(xiàn)出參地顆粒在CGN患者PBMC凋亡及MCP-1、TGF-β1的異常表達上的調(diào)節(jié)力度。

PBMC凋亡相關因子，能夠通過激活上皮細胞的凋亡通路，提高上皮細胞的程序性凋亡的風險，PBMC還能夠誘導外周血中淋巴細胞活性的改變，促進自然殺傷性T 淋巴細胞對于自身組織的損傷，加劇自身重要內(nèi)臟器官組織的損傷和功能障礙。PBMC在誘導細胞核DNA基因的轉錄障礙、抑制上皮細胞周期的調(diào)控異常等方面發(fā)揮了重要作用，從而促進了功能性細胞的凋亡和間質(zhì)成分的增生[18]。在慢性腎炎的發(fā)生發(fā)展過程中，腎臟組織中的自然凋亡細胞不能被單核巨噬細胞清除，結果導致了這些凋亡細胞的二次凋亡壞死，自身抗原成分核酸和核酸相關蛋白就從這些二次凋亡細胞的細胞核中釋放出來，沉積于腎小球，針對這些核自身抗原成分的刺激產(chǎn)生了相應的自身抗體，從而導致腎小球的免疫性損傷[19]。在損傷因素刺激下，腎小管上皮細胞的增殖與凋亡異常導致了腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[20]。本次研究發(fā)現(xiàn)CGN患者PBMC凋亡率較正常人群高，提示CGN患者存在PBMC凋亡的過度激活，這可能參與了CGN的發(fā)病過程。

Fas及Bcl-2蛋白作為經(jīng)典的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2可以通過阻止由Fas、Fadd/Mort1和Caspase8組成的死亡誘導信號復合物的形成，抑制Fas誘導細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展[21]。本次研究發(fā)現(xiàn)CGN患者存在PBMC凋亡的過度激活，同時PBMC中Fas表達較正常人群高，而Bcl-2表達較正常人群減少。Fas作為一種跨膜蛋白，與其相應的配體FasL結合即可激活致死性轉導信號通路，引發(fā)細胞死亡。Fas-FasL通路是比較典型的引起細胞凋亡的膜受體通路[22]。Bcl-2家族中有眾多成員，各成員根據(jù)其結構及功能的不同分為促細胞死亡的負調(diào)因子和抑制細胞死亡的正調(diào)因子兩大類，當細胞被外界信號刺激時，正調(diào)因子可保護細胞免于凋亡壞死。凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2主要分布于細胞核的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜上，在內(nèi)源性信號通路中起重要作用[23]。參地顆粒可以有效減少PBMC凋亡率及Fas表達，提高Bcl-2表達。

PBMC凋亡的過度激活，可以誘導炎癥因子及趨化因子MCP-1的過度分泌，并且與腎臟損傷程度呈正相關。MCP-1可由各種致炎細胞因子刺激單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等誘導分泌，而MCP-1又可通過上調(diào)單核-巨噬細胞及炎癥細胞因子等的表達來啟動或擴大炎癥反應[24]。研究發(fā)現(xiàn)MCP-1的表達下調(diào)還可改善腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤的微環(huán)境，具有改善腎間質(zhì)纖維化的作用[25]。轉化生長因子-β家族(TGF-β)在細胞生長和分化中起重要的調(diào)節(jié)作用，在酸性環(huán)境或蛋白裂解環(huán)境中均可活化TGF-β，TGF-β1是其中一個亞型，研究表明TGF-β1是一種強有力的致纖維化因子，過度表達的TGF-β1可促進腎臟細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和抑制細胞外基質(zhì)蛋白的水解，參與腎間質(zhì)纖維化的整個過程。另外其還可誘導腎小管上皮細胞生長停滯和凋亡[26]。TGF-β1水平可以一定程度反映腎臟損傷的程度，本次研究中CGN患者血清MCP-1、TGF-β1的表達較正常人增多，經(jīng)治療干預后水平較前降低。

綜上所述，參地顆?？擅黠@改善CGN脾腎虧虛證患者的臨床癥狀，消減尿蛋白。其機制可能是通過上調(diào)PBMC凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)Fas蛋白的表達，降低PBMC凋亡率，減少相應的自身抗體產(chǎn)生，下調(diào)血清炎癥因子MCP-1、TGF-β1的表達，減輕腎臟的免疫炎癥反應，減輕腎臟病理損害。