周洋媚 陳瑞 咼文靜 張孟賢

惡性膠質(zhì)瘤是成人原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，通過傳統(tǒng)的手術(shù)聯(lián)合放化療手段治療后仍有較高的復(fù)發(fā)率及死亡率，5年生存率不超過10%［1］，臨床療效及預(yù)后不佳。近年來，分子靶向及免疫治療等新治療方法不斷涌現(xiàn)并取得一定進(jìn)展。自2011年德國科學(xué)家Jean Rommelaere 首次將溶瘤病毒療法定義為腫瘤免疫治療以來，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）目前已經(jīng)被大眾接受作為免疫治療的重要分支，其在治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究中被證實(shí)具有極大的潛力。相對于傳統(tǒng)免疫治療，OVs 治療具有特異性、低毒性的優(yōu)勢。2015年美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局相繼批準(zhǔn)HSV-1類OVs T-VEC用于治療黑色素瘤，標(biāo)志著OVs技術(shù)的成熟和對OVs治療惡性腫瘤的認(rèn)可。目前已有多種OVs 用于腫瘤治療的臨床研究，其療效及安全性得到考證。本文就OVs在惡性膠質(zhì)瘤臨床治療中的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 溶瘤病毒與溶瘤病毒抗腫瘤治療

OVs 是一類能特異性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并造成細(xì)胞裂解，但又不影響其他正常組織細(xì)胞的病毒［2-4］。通常用于治療腫瘤的OVs是由自然界一些致病力較弱的病毒進(jìn)行基因工程改造后制備而成，安全性及腫瘤殺傷效應(yīng)得到進(jìn)一步完善和提高。目前認(rèn)為OVs主要通過以下作用機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)：1）在腫瘤細(xì)胞中特異繁殖，直接溶解腫瘤細(xì)胞；2）裂解的腫瘤細(xì)胞釋放病毒顆粒，通過多種途徑激發(fā)全身抗腫瘤免疫，如促進(jìn)腫瘤抗原提呈、增加腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、活化免疫細(xì)胞、通過攜帶的免疫調(diào)節(jié)因子等激活機(jī)體免疫系統(tǒng)［3，5-8］。此外，有報道［8-10］表明有些病毒可以通過感染腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制腫瘤血管生成，從而間接發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

2 溶瘤病毒與惡性膠質(zhì)瘤相關(guān)臨床試驗

2.1 單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV-1）

HSV-1是一種嗜神經(jīng)雙鏈DNA病毒，約90%成年人因早前感染過該病毒而產(chǎn)生抗體。野生型HSV-1具有神經(jīng)毒性，通過基因改造刪除其神經(jīng)毒性基因后，病毒仍可以在保持其繁殖能力同時實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)制，因此被廣泛研究改造用于制備OV。Martuza等［11］研究發(fā)現(xiàn)，刪除胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因的HSV-1突變體dlsptk可以用于治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤。TK基因編碼病毒DNA復(fù)制所必需的酶，該基因在絕大多數(shù)靜止細(xì)胞中不表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其缺失使得病毒需要依靠快速分裂的腫瘤細(xì)胞為其提供DNA復(fù)制所必需的酶。在動物實(shí)驗中，dlsptk展現(xiàn)出令人鼓舞的腫瘤清除療效，然而，TK基因的缺失導(dǎo)致了dlsptk對針對TK的抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥性，如阿昔洛韋、更昔洛韋，因此被禁止用于臨床試驗。此后研究者們通過基因工程技術(shù)設(shè)計出多種溶瘤型HSV-1 株（OHSV-1），旨在提高其靶向性同時降低神經(jīng)毒性，其在治療膠質(zhì)瘤中的臨床試驗中展現(xiàn)出較好的安全性和有效性。HSV1716是刪除雙拷貝γ34.5基因的第一代溶瘤型HSV-1株，Ⅰ期臨床試驗［12-14］顯示，HSV1716在治療惡性膠質(zhì)瘤中安全性良好，所有受試患者均未出現(xiàn)HSV相關(guān)病毒性腦炎等嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且HSV1716被證實(shí)可在腫瘤中實(shí)現(xiàn)繁殖，具有較好的溶瘤活性。二代OHSV-1在刪除γ34.5基因的同時缺失其他基因，提高了病毒的靶向性和安全性。如G207在敲除雙拷貝γ34.5基因的同時于UL39基因位點(diǎn)插入lacZ基因從而使ICP6基因失活。在復(fù)發(fā)進(jìn)展的惡性膠質(zhì)瘤患者中開展的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果顯示，患者在接受G207注射后未出現(xiàn)歸因于G207的嚴(yán)重不良反應(yīng)，影像學(xué)及病理學(xué)證據(jù)提示在一些病例中可觀察到長期的病毒復(fù)制及抗腫瘤活性［15-16］。G207聯(lián)合放療也在治療惡性膠質(zhì)瘤中被觀察到具有較好的效果［17-19］。2項關(guān)于G207聯(lián)合放療在治療兒童復(fù)發(fā)進(jìn)展惡性腦腫瘤的臨床試驗（NCT02457845，NCT03911388）分別于2015年、2019年啟動，目前仍在進(jìn)行中。三代G47△在二代基礎(chǔ)上去除了α47基因，增強(qiáng)了感染細(xì)胞主要組織相容復(fù)合物Ⅰ型（MHCⅠ）的表達(dá)，抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)一步提高［20-22］。2項關(guān)于G47△治療復(fù)發(fā)進(jìn)展膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（UMIN000002661，UMIN000015995）中，患者在治療中的耐受性良好，研究正按計劃進(jìn)行中［23］。

2.2 腺病毒（adenovirus）

腺病毒是一種雙鏈無包膜DNA病毒，在人體中有50多種血清型，其中2型和5型最常被研究用于制造溶瘤腺病毒，即條件復(fù)制腺病毒（conditionally replicative adenovirus，CRAd）。腺病毒復(fù)制分為早期（early，E）和晚期（late，L）2個階段。其中早期轉(zhuǎn)錄單元E1A基因編碼蛋白可以結(jié)合成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑制蛋白（retinoblastoma tumor suppressor protein，pRB）促進(jìn)Rb-E2F復(fù)合體釋放出E2F，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動復(fù)制［24］。E1B基因編碼蛋白可以結(jié)合p53抑制其促凋亡反應(yīng)［25］。一代ONYX-015（又稱dl1520）刪除了E1B-55KD基因，使其能在p53功能缺陷的腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制［24］。Ⅰ期臨床試驗顯示［26］，復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后瘤周接種ONYX-015安全性良好，但溶瘤效率較低，患者中位生存時間為6.2個月。然而研究發(fā)現(xiàn)，P53蛋白在腫瘤選擇性中并非主要因素［27］，限制了其臨床應(yīng)用。雖然2005年與ONYX-015類似的CRAd安柯瑞（oncorine，H101）治療頭頸部鱗癌Ⅲ期臨床試驗大獲成功促使其被中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）批準(zhǔn)上市，但目前治療惡性膠質(zhì)瘤的療效鮮見報道。另一種有前景的二代CRAd是DNX-2401（又稱△24-RDG），E1A基因的24 bp堿基缺失，使其無法結(jié)合Rb蛋白從而不能在正常組織中復(fù)制，而在Rb功能缺陷的腫瘤細(xì)胞中，E2F處于自由狀態(tài)，病毒仍然可以復(fù)制［24］。此外，由于人腺病毒5型主要通過與細(xì)胞表面的柯薩奇病毒和腺病毒受體（coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR）結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面CAR表達(dá)水平低，因此DNX-2401在設(shè)計時插入了RGD肽，使病毒能通過整合素αvβ3和αvβ5進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，腫瘤靶向性進(jìn)一步提高［28］。一項Ⅰ期臨床試驗結(jié)果顯示［29］，25例接受DNX-2401治療的復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤患者中，20%（5例）生存時間超過3年，其中3例達(dá)到完全緩解，該研究首次證明了DNX-2401在膠質(zhì)瘤中可以產(chǎn)生直接溶瘤效應(yīng)并誘導(dǎo)抗腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)。一項類似研究［30］（NCT01582516）發(fā)現(xiàn)，DNX-2401抗腫瘤作用不僅局限于溶瘤和誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)人體內(nèi)M1型抗腫瘤巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化形成，其具體臨床研究數(shù)據(jù)有待完善。目前，DNX-2401聯(lián)合其他療法治療惡性膠質(zhì)瘤的探索正在進(jìn)行中，如聯(lián)合干擾素γ（interferon-γ，INF-γ）。Lang等［31］進(jìn)行了一項DNX-2401聯(lián)合INF-γ 治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的Ⅰb 期臨床試驗（NCT02197169），結(jié)果INF-γ的加入未能提高生存率，但單藥DNX-2401臨床療效仍較佳。一項聯(lián)合放療的研究［32］顯示，DNX-2401能抑制DNA損傷修復(fù)，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤，顯著提高放療效果，下一步有望轉(zhuǎn)化為臨床研究。未來DNX-2401與免疫相關(guān)的探索將是一個主要趨勢。另外，其與替莫唑胺（tenmozolomide，TMZ）聯(lián)合應(yīng)用的臨床探索也在進(jìn)行中（NCT01956734）。在DNX-2401基礎(chǔ)改造而來的DNX-2440是三代CRAd，其表達(dá)OX40配體（OX40L），可以與T細(xì)胞表面的OX40結(jié)合，促進(jìn)腫瘤部位淋巴細(xì)胞浸潤，刺激產(chǎn)生較強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)［33］，目前已進(jìn)入膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的Ⅰ期臨床試驗（NCT03714334）。

2.3 呼腸孤病毒（reovirus）

呼腸孤病毒是一種雙鏈RNA 病毒，天然存在于哺乳動物呼吸系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)中，對正常成年人無明顯致病性，但對RAS 通路激活的細(xì)胞具有靶向裂解作用［34-35］。80%以上惡性膠質(zhì)瘤具有RAS 信號通路異常，使其成為呼腸孤病毒治療的理想靶標(biāo)。體外實(shí)驗中，呼腸孤病毒表現(xiàn)出對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞較強(qiáng)的活性［36］。2008年首項呼腸孤病毒治療惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果發(fā)表［37］，表明瘤內(nèi)注射展現(xiàn)出良好的安全性及耐受性，12 例患者均未發(fā)生與病毒治療相關(guān)的Ⅲ或Ⅳ級不良反應(yīng)。Kicielinski等［38］開展了一項類似的Ⅰ期臨床試驗，但病毒劑量較前述試驗增加了10 倍，結(jié)果再次證明呼腸孤病毒是治療惡性膠質(zhì)瘤的安全有效手段之一。Samson等［39］通過靜脈注射呼腸孤病毒治療惡性膠質(zhì)瘤取得突破性的成功，該研究首次證明呼腸孤病毒可以通過血腦屏障到達(dá)腫瘤部位，復(fù)制殺傷腫瘤細(xì)胞，并且刺激誘導(dǎo)T 細(xì)胞浸潤發(fā)揮抗腫瘤免疫，進(jìn)一步研究顯示，呼腸孤病毒可以通過INF 介導(dǎo)的機(jī)制上調(diào)腫瘤PD-L1 表達(dá)，改善隨后的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的功效，推動了今后聯(lián)合免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化研究。迄今，呼腸孤病毒聯(lián)合放化療已在多種實(shí)體瘤Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中取得較好進(jìn)展［40-41］，尤其在乳腺癌中即將進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗［42］，但在膠質(zhì)瘤中開展較少。因此，呼腸孤病毒在惡性膠質(zhì)瘤中的臨床應(yīng)用價值仍需進(jìn)一步探究。

2.4 新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）

NDV是單鏈RNA病毒，能引起禽類發(fā)生新城疫，但人感染后癥狀輕微。按其致病性可分為強(qiáng)、中等和弱毒性。某些NDV 弱毒株具有天然嗜瘤性，能選擇性引起腫瘤細(xì)胞凋亡，具有潛在的治療腫瘤作用。目前已有MTH-68/H、NDV-HUJ 兩株NDV 被應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤的治療。Csatary等［43］一項MTH-68/H治療惡性膠質(zhì)瘤的病例報告中，4例高級別多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在傳統(tǒng)抗腫瘤治療失敗后選用MTH-68/H 治療，生存質(zhì)量得到提高，生存期延長至5～9年。但因樣本量少且缺乏對照，結(jié)果需慎重思考，同時該報道也指出共治療14例患者，對治療有反應(yīng)的僅有一半患者。一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗也被開展用于評估NDV 治療惡性膠質(zhì)瘤的安全性及可行性，11 例受試者中5 例出現(xiàn)輕微發(fā)熱，5 例檢出抗NDVHUJ 抗體，1 例完全緩解［44］?？傮w而言，NDV 治療惡性膠質(zhì)瘤被初步證實(shí)安全性可靠且具有一定療效，但相關(guān)臨床研究較少，尚未取得較大突破。Koks等［45］發(fā)現(xiàn)在原位免疫活性的膠質(zhì)瘤模型中，NDV 能引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD），啟動強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫和腫瘤特異性免疫記憶，鼓舞了NDV 聯(lián)合免疫療法治療惡性膠質(zhì)瘤研究探索。目前，其他基于NDV 治療惡性膠質(zhì)瘤的策略正在探索中，如NDV 修飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗（autologous tumor vaccine，ATV-NDV）［46］、聯(lián)合TMZ［47］等。

2.5 脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）

PV是無包膜單鏈RNA病毒，是天然的神經(jīng)病原體，具有固有的神經(jīng)侵襲性。其通過細(xì)胞表面的PV受體CD155（又稱Necl5）入侵細(xì)胞，由于CD155在膠質(zhì)瘤等實(shí)體腫瘤中廣泛表達(dá)［48］，使其具有強(qiáng)大的抗腫瘤潛力。然而，CD155也存在于某些正常的神經(jīng)元細(xì)胞中，因此需要一種策略來選擇性降低其對正常神經(jīng)元細(xì)胞的毒性而使PV靶向CD155的臨床應(yīng)用成為可能。美國杜克大學(xué)研究人員通過將Ⅰ型減毒活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗疫苗（sabin）內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosomal entry site，IRES）替換成人2型鼻病毒（human rhinovirus type 2，HRV2）的IRSE，制備出重組非致病性脊髓灰質(zhì)炎病毒-鼻病毒嵌合體（PVSRIPO），這種外來的IRSE影響了病毒招募宿主核糖體、啟動翻譯的過程，但不改變病毒復(fù)制動力學(xué)，能在消除神經(jīng)毒性的同時保留腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)制能力［49］。研究發(fā)現(xiàn)，PVSRIPO除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可以通過感染人樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生持久的INF顯性激活，誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用［50］。2018年該療法治療惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果發(fā)表并引發(fā)廣泛關(guān)注，61例瘤內(nèi)注射PVSRIPO的幕上型復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤患者中位生存期達(dá)12.5個月，雖然較歷史對照組11.3個月相似，但2年生存率達(dá)21%，較歷史數(shù)據(jù)（14%）提高了50%，3年生存率21%，對比歷史數(shù)據(jù)4%更是提高了5倍［51-52］。這表明，與免疫治療相似，PVSRIPO治療后患者一旦出現(xiàn)緩解，將可能出現(xiàn)持久的抗腫瘤作用，顯著延長生存時間，臨床治療前景可觀。在安全性方面，約69%患者僅出現(xiàn)輕微不良反應(yīng)，包括頭痛、抽搐、偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，1例患者出現(xiàn)劑量限制性毒性［51］?；谄淞己玫臄?shù)據(jù)，美國食品和藥品管理局授予了PVSRIPO 突破療法資格認(rèn)證，推動了PVSRIPO單獨(dú)或聯(lián)合其他療法治療惡性膠質(zhì)瘤相關(guān)研究的開展。

2.6 其他

麻疹病毒（measles virus，MV）通過與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD46受體結(jié)合入侵細(xì)胞，將病毒改造后制備成產(chǎn)生分泌性癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的MV-CEA，使其易于被體外儀器檢測，有利于研究者掌握病毒在體內(nèi)的繁殖情況。體外惡性膠質(zhì)瘤模型中，溶瘤麻疹病毒展現(xiàn)出較好的溶瘤活性并被證實(shí)與放療具有協(xié)同作用，目前已有Ⅰ期臨床試驗展開（NCT00390299）。一項研究（NCT01301430）發(fā)現(xiàn)H1細(xì)小病毒（ParvOryx）能通過血腦屏障，誘導(dǎo)建立免疫原性腫瘤微環(huán)境［53］，為OVs治療惡性膠質(zhì)瘤增添一新候補(bǔ)。其他OVs如牛痘病毒、水泡性口炎病毒等也在積極開發(fā)探索中，但目前在惡性膠質(zhì)瘤中主要處在前臨床研究中，未來有望成為進(jìn)一步臨床開發(fā)的候選。

3 溶瘤病毒治療惡性膠質(zhì)瘤的挑戰(zhàn)及發(fā)展方向

近20年來，OVs 用于治療膠質(zhì)瘤的研究取得了令人鼓舞的結(jié)果，一系列基因工程技術(shù)的應(yīng)用使得OVs 治療具有更高的特異性、有效性及安全性，越來越多OVs 研究進(jìn)入Ⅰ、Ⅱ期甚至Ⅲ期臨床試驗。然而，目前OVs 治療腫瘤仍存在諸多挑戰(zhàn)，首要是安全性問題，雖然目前已發(fā)表的數(shù)據(jù)未顯示出重大的安全問題，但是仍有脫靶效應(yīng)的可能性，基因操作后的病毒也可能存在意料不到的毒性［54］，老年人或免疫系統(tǒng)受損的患者可能會因此發(fā)生病毒感染產(chǎn)生嚴(yán)重后果。其次是給藥途徑，目前大多數(shù)治療膠質(zhì)瘤的OVs均通過直接瘤內(nèi)注射局部給藥，存在出血、感染、組織損傷等風(fēng)險，其安全性及便利性有待進(jìn)一步優(yōu)化；而靜脈給藥時則需要克服血腦屏障才能到達(dá)瘤床發(fā)揮效應(yīng)，并且血液中特異性中和抗體的存在也會限制OVs的傳遞及有效性，病毒可能在表現(xiàn)潛在抗腫瘤效應(yīng)之前被迅速消滅，靜脈給藥還可能引起全身擴(kuò)散，導(dǎo)致嚴(yán)重的非靶向性感染［55］。此外，如何提高溶瘤療效也是重要難題，OVs引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)是其重大優(yōu)勢，目前OVs聯(lián)合免疫治療的策略在多項研究中展現(xiàn)出獨(dú)特的療效，如何利用外來基因增強(qiáng)OVs 抗腫瘤免疫應(yīng)答或優(yōu)化聯(lián)合治療策略需要進(jìn)一步探索實(shí)踐，這也將是未來OVs研究發(fā)展的主要方向。然而，免疫反應(yīng)同樣能抑制病毒復(fù)制，因此如何平衡好針對病毒和腫瘤抗原的免疫應(yīng)答也是需要考慮的因素之一。

4 結(jié)語

綜上所述，OVs可以通過多種機(jī)制特異性靶向和殺傷腫瘤細(xì)胞，大量臨床前及臨床試驗結(jié)果使得OVs治療惡性膠質(zhì)瘤的安全性得到認(rèn)可，但抗腫瘤療效有待進(jìn)一步提高。此外，OVs的溶瘤機(jī)制尚未完全闡釋，未來如何聯(lián)合其他療法或通過基因工程改造進(jìn)行病毒重組以提高療效有待進(jìn)一步探索實(shí)踐。