楊 冰，馬天宇，馬 維

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，石家莊 050000

骨折是臨床上的常見病、多發(fā)病。最新的研究表明，我國(guó)每年約有440萬人經(jīng)歷過創(chuàng)傷性骨折，且骨折發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[1-2]。骨折愈合一直是骨科醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)骨折發(fā)生率為2704/(10萬人·年)，其中約10%的骨折患者存在骨折愈合不良或骨不愈合的情況，這不僅增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和住院時(shí)間，還會(huì)造成患者長(zhǎng)期病痛、患肢功能殘缺，極大地影響患者的生活質(zhì)量[3]。有研究顯示神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)具有促進(jìn)骨折愈合的作用，現(xiàn)就NGF促進(jìn)骨折愈合的研究進(jìn)展做一綜述。

NGF結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制

NGF的結(jié)構(gòu)NGF于上世紀(jì)50年代首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[4]。NGF由α、β、γ 3個(gè)亞基構(gòu)成，有生物活性的部分為βNGF。βNGF是一種二聚體，由3個(gè)半胱氨酸鍵連接[5- 6]，其相對(duì)分子質(zhì)量為2.65×104，沉降系數(shù)為2.5 S[7]。目前認(rèn)為，NGF是一種通過旁分泌和自分泌作用的激素樣物質(zhì)，其屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)的一種，其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括腦源性NGF、NT- 3、NT- 4等，NGF是保障神經(jīng)存活、生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育、功能和可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[8]。

NGF的作用機(jī)制NGF通過與高親和力特異性受體酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor A，TrkA)和低親和力受體p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。TrkA受體是典型性的酪氨酸激酶受體。TrkA受體與NGF結(jié)合，發(fā)生磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路：絲裂原活化蛋白激酶通路、磷酸磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路和磷脂酶C-γ通路[9]。p75NTR可以調(diào)節(jié)TrkA受體的親和力和選擇性。NGF也可以單獨(dú)與p75NTR結(jié)合激活核內(nèi)因子-κB(nuclear factor kappa-B，NFκB)通路。以上所有通路均促進(jìn)細(xì)胞存活和/或分化[10]。另一方面，成熟NGF的前體可以與p75NTR/分揀受體作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

NGF在臨床的應(yīng)用現(xiàn)狀目前，NGF在臨床中主要用于治療神經(jīng)損傷和眼科疾病。NGF對(duì)膽堿能神經(jīng)的完整性和功能維持發(fā)揮重要作用，有助于各種神經(jīng)退行性病變中神經(jīng)元的存活和再生。Rocco等[12]總結(jié)回顧了關(guān)于NGF早期和最近的臨床研究，認(rèn)為NGF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、上皮病變、角膜病變及青光眼等有治療作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子臨床應(yīng)用專家共識(shí)也指出，應(yīng)用NGF在腦卒中、顱腦損傷、脊髓損傷、周圍神經(jīng)病新生兒缺血缺氧性腦病、腦性癱瘓等各種神經(jīng)損傷疾病中均有一定療效[13]。另有研究顯示，NGF-TrkA-p75NTR通路在結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、髓系白血病等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)活躍，小分子抑制劑或阻斷NGF-TrkA-p75NTR通路可能成為治療腫瘤的新方向[14]。

NGF促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制

NGF促進(jìn)骨折部位神經(jīng)纖維生長(zhǎng)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持被認(rèn)為與骨組織的形成和愈合有關(guān)，成熟骨組織有豐富的神經(jīng)纖維支配。缺少神經(jīng)纖維支配，骨組織生長(zhǎng)遲緩，痛感降低。NGF可以影響神經(jīng)纖維可塑性，促進(jìn)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入骨組織[15]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，骨折愈合過程中骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨折相關(guān)巨噬細(xì)胞等表達(dá)NGF上調(diào)，在富NGF區(qū)域內(nèi)，神經(jīng)纖維生長(zhǎng)較快，抑制NGF的受體TrkA受體，明顯減少感覺纖維的數(shù)量，延緩骨折血管化和骨化過程。NGF促進(jìn)肽能神經(jīng)在骨折區(qū)域的生長(zhǎng)和發(fā)育，這些神經(jīng)纖維可釋放神經(jīng)肽遞質(zhì)，如降鈣素基因相關(guān)肽，能通過刺激骨細(xì)胞有絲分裂和骨間質(zhì)細(xì)胞分化達(dá)到刺激骨形成的作用；P物質(zhì)在體外培養(yǎng)狀態(tài)下也能刺激成骨細(xì)胞，使其成骨能力增強(qiáng)[17]。

NGF促進(jìn)血管再生在骨折愈合過程中，血管的生成是骨形成和修復(fù)的基本過程之一，早期的血管再生對(duì)骨折愈合的正常進(jìn)行至關(guān)重要。血管再生主要通過內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管從現(xiàn)有血管向骨折斷端延伸而成。NGF通過自分泌和旁分泌參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的維持、存活、功能。Lazarovici等[18-19]和Dolle等[20]通過一系列體外內(nèi)皮細(xì)胞管實(shí)驗(yàn)與鵪鶉絨毛膜實(shí)驗(yàn)證明，NGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)新生血管有趨化生長(zhǎng)作用，并且可以促進(jìn)新生血管的成熟。NGF促進(jìn)血管再生的機(jī)制主要有兩方面：(1)NGF通過激活TrkA受體，直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷徙。Park等[21]發(fā)現(xiàn)NGF可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，顯著刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲，主要原因是NGF-TrkA復(fù)合物激活PI3K/Akt信號(hào)通路和激活蛋白- 2轉(zhuǎn)錄因子刺激基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase- 2，MMP- 2)mRNA表達(dá)及蛋白分泌。利用TrkA抑制劑K252a、PI3K/Akt均能阻斷NGF誘導(dǎo)的MMP- 2增高，而應(yīng)用MMP- 2抑制劑或在MMP- 2基因敲除的小鼠體內(nèi)，NGF促進(jìn)新生血管增殖和侵襲的作用顯著下降；(2)NGF促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。Diao等[22]發(fā)現(xiàn)在小鼠后肢缺血模型中，NGF轉(zhuǎn)染后小鼠患肢較對(duì)照組新生毛細(xì)血管密度更高、CD34陽性細(xì)胞表達(dá)更多、肌肉萎縮程度更低，這可能與NGF轉(zhuǎn)染促進(jìn)VEGF的表達(dá)有關(guān)。Chen等[23]研究顯示，局部應(yīng)用NGF可以促進(jìn)骨缺損周圍組織的神經(jīng)與血管再生，且促進(jìn)VEGF的表達(dá)。Dolle等[20]研究顯示，NGF對(duì)人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠腎上腺髓質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙均有促進(jìn)作用，對(duì)人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步研究顯示，這種促進(jìn)作用與VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等作用類似，且可以被TrkA受體抑制劑K252a阻斷。

NGF調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝在骨折愈合過程中，軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的數(shù)量、生物活性及成熟至關(guān)重要，各種細(xì)胞相互作用，完成骨的生成和重塑。NGF及其受體在骨折愈合過程中各種骨相關(guān)細(xì)胞中均有表達(dá)。于立明等[24]制作兔下頜骨橫行骨折模型，于術(shù)后1、3、5、7、14、21、28 d處死動(dòng)物，取下頜骨骨折處組織脫鈣后制作骨組織石蠟切片，分別行HE染色、NGF及其受體免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在骨折愈合過程中的成骨細(xì)胞中，NGF呈陽性表達(dá)，3～5 d達(dá)到高峰；TrkA受體呈強(qiáng)陽性表達(dá)，7 d達(dá)到高峰，到21 d時(shí)軟骨細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)陽性；p75受體在骨折愈合過程中表達(dá)陽性，5～7 d達(dá)到高峰，到21 d時(shí)仍為陽性表達(dá)。一方面，NGF可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與成熟，其機(jī)制仍不完全清楚。有研究者認(rèn)為，NGF與成骨細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，使其發(fā)生磷酸化，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞活性及功能活動(dòng)，在成骨細(xì)胞分化過程中，NGF可以促進(jìn)堿性磷酸酶活性，增加Ⅰ型膠原蛋白的合成[25]；Fan等[26]認(rèn)為TrkA信號(hào)在主動(dòng)分裂成骨細(xì)胞中具有抗凋亡作用；Johnstone等[27]利用選擇性TrkA激動(dòng)劑藤黃酰胺治療小鼠腓骨骨折，顯微CT和生物力學(xué)分析顯示治療后骨痂更堅(jiān)固，體外分析表明，其可直接作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞成熟和礦化。另一方面，NGF調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活動(dòng)。破骨細(xì)胞來自單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，受NF-κB信號(hào)調(diào)解發(fā)揮骨吸收的作用。體外研究表明，NGF具有在不依賴NF-κB受體的條件下誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用，可形成大量抗酒石酸堿性磷酸酶染色陽性和玻璃體蛋白結(jié)合受體染色陽性細(xì)胞，在骨吸收和骨重塑過程中發(fā)揮重要作用[28]。

NGF通過與其他細(xì)胞因子的相互作用影響骨折愈合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein- 2，BMP- 2)是目前最肯定的具有誘導(dǎo)成骨作用的生長(zhǎng)因子，在修復(fù)骨缺損及愈合中效果顯著。呂桂浩等[29]應(yīng)用NGF治療合并局部神經(jīng)束損傷的兔下頜骨折，結(jié)果顯示神經(jīng)生長(zhǎng)因子能促進(jìn)BMP- 2在骨折局部的表達(dá)，促進(jìn)成骨。劉宇鵬等[30]研究也顯示，NGF能促進(jìn)兔橈骨骨折骨組織中BMP- 2的濃度，且使BMP- 2表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)、峰值提前、下降減緩，經(jīng)NGF治療后骨折愈合更快，重塑時(shí)間提前。馬聘等[31]通過觀察大鼠脛骨骨折愈合過程，發(fā)現(xiàn)NGF能促進(jìn)大鼠骨痂愈合，促進(jìn)Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達(dá)。使用NGF治療后，骨痂的生物力學(xué)抗彎折能力更強(qiáng)。在骨折愈合早期，NGF能促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)，在愈合中后期，NGF能促進(jìn)Ⅰ型膠原的分泌并促進(jìn)骨痂骨化。胰島素樣生長(zhǎng)因子- 1可促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的合成代謝，促進(jìn)成骨[32]。劉建軍等[33]發(fā)現(xiàn)NGF能促進(jìn)大鼠脛骨骨折斷端骨痂中的胰島素樣生長(zhǎng)因子- 1的表達(dá)，增加骨痂體積和重量，加速骨折愈合。以上研究表明，NGF促進(jìn)骨折愈合可能是個(gè)復(fù)雜的多種作用途徑的過程，NGF通過與表達(dá)于各種細(xì)胞表面的受體作用，促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子的釋放，在骨折局部提供一個(gè)有利于骨折愈合的微環(huán)境。

NGF促進(jìn)骨折愈合的臨床與實(shí)驗(yàn)研究

NGF促進(jìn)骨折愈合的基礎(chǔ)研究Liu等[34]分別使用NGF和NGF單克隆抗體處理兔橈骨骨折，發(fā)現(xiàn)治療后24 h、48 h、1周、3周、6周、8周時(shí)使用NGF治療的動(dòng)物骨折部位VEGF表達(dá)較對(duì)照組增加，VEGF在骨折3周后達(dá)到峰值，而使用NGF拮抗劑后，骨折愈合減慢，且骨折局部的VEGF表達(dá)減少。與以往實(shí)驗(yàn)相比，分別從直接NGF治療和抑制NGF表達(dá)兩方面證明了NGF的促骨折愈合作用。以往研究多使用NGF局部注射觀察其對(duì)骨折愈合的作用，因注射部位、注射劑量的不同，療效不穩(wěn)定，且多未研究NGF促骨折愈合的機(jī)制。Sang等[35]利用NGF轉(zhuǎn)基因純合子小鼠構(gòu)建脛骨骨折模型，發(fā)現(xiàn)NGF轉(zhuǎn)基因純合子小鼠骨折NGF mRNA表達(dá)水平升高，骨折愈合較快，經(jīng)TRAP染色及TRAP mRNA檢測(cè)、番紅綠染色證明NGF純合子小鼠骨折部位破骨細(xì)胞增殖更多，軟骨分化更快，其機(jī)制可能與COL2A1和SOX9表達(dá)增多有關(guān)。近期研究多認(rèn)為NGF可直接調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的代謝。崔國(guó)勝等[36]在體外使用骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell，BMSC)研究顯示，NGF通過與TrkA受體結(jié)合促進(jìn)BMSC體外成骨向分化，可增強(qiáng)BMSC的礦化能力。NGF在骨不連的治療中也有重要作用。劉宇濤等[37]研究顯示，局部注射NGF對(duì)新西蘭大白兔脛骨骨不連模型有較強(qiáng)的促進(jìn)骨不連骨痂生長(zhǎng)和愈合作用，NGF組12周時(shí)骨折線完全消失，達(dá)到骨性愈合，組織學(xué)檢查可見骨折斷端有大量活躍的成骨細(xì)胞。目前，關(guān)于NGF的基礎(chǔ)研究雖證實(shí)了其對(duì)骨折愈合過程的促進(jìn)作用，但其作用機(jī)制尚無明確闡述。各項(xiàng)研究多局限于探討NGF的某一方面作用，對(duì)NGF各種作用機(jī)制之間的相互作用沒有深入研究。各項(xiàng)研究使用的NGF劑量、注射方法、動(dòng)物模型、評(píng)價(jià)指標(biāo)等均不一致，缺乏統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的研究模型，妨礙了對(duì)各研究的交流比較。

NGF促進(jìn)骨折愈合的臨床試驗(yàn)關(guān)于NGF對(duì)骨折患者的愈合過程影響的研究較少，且質(zhì)量較低。張宏亮等[38]通過檢索國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)評(píng)價(jià)NGF對(duì)骨折愈合的影響，共納入5篇隨機(jī)對(duì)照研究，認(rèn)為mNGF可減少患者的愈合時(shí)間，但不良反應(yīng)有一定增加。所納入的隨機(jī)對(duì)照研究根據(jù)推薦等級(jí)的評(píng)估、制訂與評(píng)價(jià)系統(tǒng)推薦分級(jí)為低等級(jí)，納入病例較少，缺乏強(qiáng)有力的支持證據(jù)。在最近的一項(xiàng)研究中，張遠(yuǎn)華等[39]應(yīng)用NGF治療創(chuàng)傷性骨不連患者43例(共納入86例)，患者骨痂出現(xiàn)時(shí)間、骨折愈合時(shí)間均早于對(duì)照組，認(rèn)為NGF對(duì)四肢骨折不愈合與延遲愈合患者有顯著地臨床療效，且治療安全性高。因國(guó)外尚未批準(zhǔn)使用NGF治療骨折的臨床試驗(yàn)，研究多為在合并腦外傷等自身NGF增加的情況下，認(rèn)為腦外傷合并骨折患者骨折愈合加快與NGF有關(guān)[40]。目前，NGF促進(jìn)骨折愈合仍缺乏大樣本、高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)。

NGF臨床應(yīng)用前景及面臨的問題

NGF治療骨折愈合仍有許多問題亟待解決。NGF為大分子物質(zhì)，無法通過血液循環(huán)作用于骨折局部，目前研究多采用骨折部位局部注射治療，但此方法可能導(dǎo)致骨折愈合過程疼痛加重[41]。且NGF易降解，給藥后24～26 h可代謝分解，使用NGF治療骨折需大劑量、長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)注射，這大大限制了NGF的臨床應(yīng)用。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，采用各種高分子緩釋材料如聚乳酸材料、磷酸鈣支架等制備NGF緩釋藥物或材料可維持穩(wěn)定有效的NGF濃度[42]，有望解決NGF的應(yīng)用限制。骨折愈合過程是復(fù)雜的，神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合可能是通過多種機(jī)制，進(jìn)一步的研究應(yīng)側(cè)重于NGF對(duì)各種細(xì)胞及因子的相互作用，闡述NGF的各種作用機(jī)制之間是否相互影響。

NGF可通過促進(jìn)骨折斷端的血管再生和神經(jīng)纖維長(zhǎng)入，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的代謝等方面加速骨折愈合。但目前NGF促進(jìn)骨折愈合仍缺乏可信的臨床證據(jù)，仍需要進(jìn)一步的多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證NGF促進(jìn)骨折愈合的臨床效果與作用機(jī)制。目前，臨床上仍有5%～10%的骨折患者存在骨愈合不良或骨不連，應(yīng)用安全有效、非手術(shù)方式促進(jìn)骨折愈合、治療骨不連是骨科研究的重要課題之一。局部應(yīng)用NGF制劑具有安全高效、方便直接、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，關(guān)于NGF的進(jìn)一步研究和應(yīng)用，可能會(huì)為骨不連的治療提供一個(gè)可行的、無創(chuàng)的解決方案。