李 外，何新榮

（中國人民解放軍總醫(yī)院藥學部藥品供應保障中心，北京 100853）

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，功能活血行氣，祛風止痛[1]，為治療頭痛要藥。川芎所含生物有效成分主要包括四大類：酚類和有機酸類（如阿魏酸）、苯酞類化合物（如藁本內酯）、生物堿類（如川芎嗪）、多糖類[2]。臨床上常與天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參等配伍用于治療各種心腦血管疾病[3-5]，如川芎配伍天麻治療偏、正頭痛，配伍細辛等用于治療諸頭痛癥，配伍丹參等治療心脈瘀阻，配伍連翹治療熱滯血瘀證，配伍赤芍等治療血瘀頭痛，配伍黨參等治療心絞痛[6-8]。因此，川芎的配伍極具研究價值，尤其是配伍理論與藥效物質基礎的關系。本實驗基于物質基礎角度考察川芎及配伍用藥特點，為探討和優(yōu)化川芎中醫(yī)臨床上配伍及進一步揭示其藥效機制提供研究基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，配有G1311A四元泵、G1322A脫氣機、G1329A進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器（美國安捷倫公司）；FW135中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；TP432自動電位滴定儀（北京時代新維測控設備有限公司）；FA-1004電子天平（上海精科儀器有限公司）；YP601N電子秤（上海菁海儀器有限公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

川芎飲片（批號：16070201、16090301、17020401、17030301、18080501、18100301）、天麻飲片（批號：18033101）、細辛飲片（批號：17031102）、丹參飲片（批號：18030901）、連翹飲片（批號：17111001）、黨參飲片（批號：18052801）和赤芍飲片（批號：18081101）均購自北京綠野藥業(yè)有限公司。中藥飲片鑒定人為我院藥學部李外副主任藥師。所有飲片分析前于40 ℃烘干至恒重，粉碎成粗粉。阿魏酸對照品（批號：110773-201614）、藁本內酯對照品（批號：110664-201623）均購自中國藥品生物制品檢定所。磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）購自國藥集團化學試劑有限公司；水為蒸餾水和三蒸水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸、藁本內酯對照品適量，用甲醇溶解并定溶至10 mL容量瓶中，配制得阿魏酸384 μg·mL-1、藁本內酯22 μg·mL-1的對照品母液，精密量取各對照品母液，甲醇制成每1 mL含阿魏酸380 μg、藁本內酯0.242 μg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

稱取川芎、天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參飲片若干份，每份各5 g，分成川芎、天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參單煎組和川芎-天麻、川芎-細辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對組，每組各3份。置于250 mL的燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，浸泡2 h，水浴加熱，水沸后計時，1 h取出稱重，補足減失的重量，趁熱抽濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，得川芎、天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參單煎供試液，以及川芎-天麻、川芎-細辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對配伍合煎供試液，各3份，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：InertSustainBio C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測器：DAD，檢測波長為321 nm。流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。流動相：乙腈（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，溶劑比例：0 ～ 5 min，A：5% ～10%；5 ～ 15 min，A：10% ～ 30%；15 ～ 20 min，A：30% ～40%；20 ～ 30 min，A：40% ～ 55%；30 ～ 40 min，A：55%～ 80%；40 ～ 45 min，A：80% ～ 5%。進樣量：10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.2”項下川芎單煎供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件各連續(xù)進樣6次，進樣量10 μL。分別記錄阿魏酸和藁本內酯色譜峰保留時間和峰面積，計算該兩種有效成分色譜峰保留時間RSD分別為0.37%和0.45%，峰面積RSD分別為0.98%和0.92%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2”項下川芎單煎供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣，進樣量10 μL，記錄阿魏酸和藁本內酯色譜峰峰面積，計算該兩種有效成分色譜峰峰面積的RSD分別為1.34%和1.76%。表明川芎供試品溶液中阿魏酸、藁本內酯在24 h內基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取同一批川芎和丹參飲片，按“2.2”項下方法平行制備川芎-丹參配伍合煎供試品溶液6份，分別按“2.3”項下色譜條件進行測定，進樣量10 μL，記錄每份樣品中阿魏酸、藁本內酯色譜峰峰面積，計算阿魏酸、藁本內酯的相對峰面積的RSD分別為1.66%和1.45%，表明該方法重復性良好。

2.5 川芎單味、配伍藥對特征圖譜的研究

2.5.1 川芎及配伍組HPLC特征圖譜的建立 按“2.3”項下色譜條件，將6批川芎水煎煮供試品溶液進行測定，根據(jù)HPLC指紋圖譜檢測結果，按中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”進行計算，分別對各批次樣品指紋圖譜進行匹配，相似度的計算采用多點校正、色譜峰自動匹配，得出相應的對照圖譜，選擇吸收信號較強、穩(wěn)定性好、峰形明顯的12個色譜峰標定為共有峰，見圖1。對川芎單煎液指紋圖譜進行相似度評價，可知在45 min內全部出峰完畢，其指紋圖譜相似度均＞0.974，指紋圖譜相似度高。

圖1 川芎水煎液HPLC特征指紋圖譜注：S1 ～ S6 - 1 ～ 6批川芎樣品；R - 對照圖譜Fig 1 Characteristic fingerprint of chuanxiong decoction by HPLCNote：S1 ～ S6 - 1 ～ 6 batches of Chuanxiong Rhizoma samples；R -contrast chromatography

2.5.2 色譜峰的歸屬分析 在“2.3”項下色譜條件下，將川芎、天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參水煎煮供試品溶液以及川芎-天麻、川芎-細辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參配伍合煎煮供試品溶液以阿魏酸和藁本內酯混合對照品溶液進行檢測，根據(jù)HPLC檢測結果對各供試品溶液中各色譜峰進行歸屬，可以確定共有特征峰均來自各個單煎組，色譜峰的個數(shù)沒有新增加或是減少，其中8號峰為阿魏酸，12號峰為藁本內酯，表明川芎與諸藥配伍沒有新的化合物產生或是消失。將川芎和川芎-天麻、川芎-細辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對組的對照圖譜疊加，見圖2。

圖2 川芎及配伍組HPLC指紋圖譜的對照圖譜A - 川芎單煎組，B - 川芎-天麻組，C - 川芎-細辛組，D - 川芎-丹參組，E - 川芎-連翹組，F(xiàn) - 川芎-赤芍組，G - 川芎-黨參組；1- 阿魏酸；2 - 藁本內酯Fig 2 Contrast chromatogram of HPLC fingerprint of Chuanxiong and compatibility groupsA - Chuanxiong Rhizoma group, B - compatibility group with Gastrodiae Rhizoma, C - compatibility group with Asari Radix et Rhizoma, D - compatibility group with Salvia miltiorrhiza Radix et Rhizoma, E - compatibility group with Forsythiae Fructus, F -compatibility group with Paeoniae Radix rubra, G - compatibility group with Codonopsis Radix; 1 - ferulic acid, 2 - ligustilide

2.6 有效成分含量變化研究

2.6.1 線性關系考察 按“2.3”項下色譜條件，取“2.1”項下對照品混合液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μL，進樣，分別記錄阿魏酸和藁本內酯峰面積，以進樣量為橫坐標x，峰面積為積分值y，繪制回歸曲線，并計算阿魏酸和藁本內酯的線性范圍。計算得阿魏酸的回歸曲線：y1= 5 193.98 x1+ 22.17，R1= 0.999 9；藁本內酯的回歸曲線：y2= 1 773.46 x2-0.51，R2= 0.999 9。結果表明，阿魏酸和藁本內酯分別在0.038 ～ 1.900 mg、0.242 ～ 12.100 μg濃度范圍內呈良好線性關系。

2.6.2 加樣回收試驗 取已知含量的同一批川芎飲片6份，每份5 g，精密稱定，分別加入阿魏酸和藁本內酯混合對照品適量，按“2.2”項下方法制備川芎供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，進樣量10 μL，計算加樣回收率。計算阿魏酸和藁本內酯平均回收率分別為98.21%和98.50%，RSD分別為0.42%和0.37%。

2.6.3 樣品含量的測定 取“2.2”項下川芎的單煎液，及與天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參配伍合煎液，各3份，按“2.3”項下色譜條件，分別進樣10 μL。記錄各供試品中阿魏酸、藁本內酯的峰面積，按“2.6.1”項下曲線方程計算各樣品中阿魏酸、藁本內酯的含量，各供試品煎出含量結果見表1。與川芎單煎液組比較，有效成分含量變化結果顯示，藥對配伍組中藁本內酯含量均升高；細辛、丹參、赤芍、黨參與川芎藥對配伍阿魏酸的含量均升高，天麻-川芎組阿魏酸的含量降低，連翹-川芎組無顯著變化。

3 討論

3.1 川芎藥對配伍特點及研究思路

“藥對”配伍用藥本是中醫(yī)用藥的特色，在中醫(yī)臨床上，川芎為中藥處方中常用藥味，且在組方中常配伍丹參、細辛、天麻、連翹、赤芍和黨參等組成藥對用藥來治療各種腦血管疾病，配伍用藥的臨床案例[9-11]較多，但其配伍的基礎研究較少，相關研究的關注點多在單味藥炮制前后的成分變化，缺乏配伍后成分及有效成分煎出率的影響數(shù)據(jù)，且臨床實踐中，中藥飲片多是水煎入藥，進入人體內的均是能用水煎煮出來的化學物質[12-13]。因此，本研究采用傳統(tǒng)的水煎煮方法結合現(xiàn)代精密的檢測方法，擬從有效成分煎出含量方面考察中醫(yī)配伍用藥的特點，能更真實挖掘川芎配伍規(guī)律與臨床藥效的關系。

表1 川芎單煎及與羌活等藥合煎樣品中有效成分含量.mg·g-1，n = 3Tab 1 The content of effective components in single and combined decoction samples. mg·g-1, n = 3

3.2 川芎配伍研究實驗結果思考

川芎的主要化學成分為川芎嗪、阿魏酸和藁本內酯，也是研究主要考察點。本研究檢測阿魏酸和藁本內酯的含量變化，同時考察了川芎飲片水煎煮液中川芎嗪的含量，結果發(fā)現(xiàn)，川芎嗪的含量極低。在考察其他不同的提取方法，進行驗證試驗后發(fā)現(xiàn)不同批次原藥材中川芎嗪含量均較低。因此，本研究主要考察川芎中阿魏酸和藁本內酯兩個藥效成分。天麻、細辛、丹參、連翹、赤芍、黨參均會影響川芎中有效成分阿魏酸和藁本內酯的煎出量，尤其對藁本內酯的影響顯著，配伍后藁本內酯含量增加，勢必會增加藁本內酯的抗動脈粥樣硬化、神經保護、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性，因此，在臨床上表現(xiàn)出配伍增效的作用。

綜上，研究川芎與諸藥配伍，是基于真實世界研究人體內藥效物質基礎與臨床配伍的關系，以期望能為中醫(yī)臨床上組方配伍劑量比提供數(shù)據(jù)依據(jù)。有研究[14]報道，輔助用藥分類中，以活血化瘀類品種最多，尤其是中藥復方制劑，其不合理的配伍使用時常發(fā)現(xiàn)?；趯Ρ緦嶒灲Y果的深入討論和分析，從藥物經濟學和安全用藥角度出發(fā)，建議臨床中醫(yī)師在開具川芎飲片時，了解其配伍后有效成分的變化規(guī)律，恰當配伍以增強臨床療效。另外，本研究為進一步揭示川芎的藥效機理提供了物質基礎方面的數(shù)據(jù)支持。