杜孫兵,楊文秋,吳 倩,韓雁冰

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,昆明 650032)

癲癇是一種反復(fù)癲癇發(fā)作、腦電圖異常放電為特征的慢性腦部疾病。 目前全世界約有1%的人患有癲癇,其中約三分之一的患者耐藥,即使長期服多種藥物仍無法控制發(fā)作,給患者及其家庭造成極大困擾,世界衛(wèi)生組織已把癲癇列為世界五大神經(jīng)精神疾病之一[1-2]。 鑒于癲癇高耐藥率和嚴重危害,迫切需要尋找新的抗癲癇藥。 近年來研究發(fā)現(xiàn),鈉鉀ATP 酶(Na+,K+-ATPase,NKA)與癲癇發(fā)作密切相關(guān),尤其活性改變可影響癲癇易感性,可能是潛在的抗癲癇治療靶點。 本文將從NKA 分型、分布、功能,及其與癲癇的關(guān)系,可能參與發(fā)病和調(diào)控機制等方面逐一綜述。

1 NKA 的功能、組成及分布

NKA 是P 型離子轉(zhuǎn)運ATP 酶中最重要的成員,是哺乳動物細胞膜上普遍存在的跨膜蛋白。NKA 又被稱為鈉鉀泵,負責把分解三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)獲得的能量用來完成影響Na+、K+離子的主動轉(zhuǎn)運,將細胞外相對細胞內(nèi)較低濃度的鉀離子送進細胞,并將細胞內(nèi)相對細胞外較低濃度的鈉離子送出細胞,對維持細胞的靜息電位、調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性至關(guān)重要[3-4]。 NKA 由α、β 和FXYD 亞基組成。 α 亞基為催化亞基,由十個跨膜螺旋片段組成,是Na+、K+離子的結(jié)合位點。 α亞基有三個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域:核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域,磷酸化結(jié)構(gòu)域和激動結(jié)構(gòu)域[3],分別由ATP1A1-A4 基因編碼,對應(yīng)α1-α4 四個亞型:α1 在各組織細胞廣泛表達；α2 主要表達在腦、心臟、肌肉等；α3 主要分布于腦、視網(wǎng)膜、心臟等；α4 主要在睪丸中表達。 在腦內(nèi)的NKA 的三個α 亞型分布的細胞不同:α1 在神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞均有表達,α2 主要分布在星形膠質(zhì)細胞,而α3 主要存在神經(jīng)元內(nèi)[3,5-6]。 β 亞基由一個跨膜片段及一個高度糖基化的胞外域組成,有β1-β3 三個亞型,β1 存在于各類組織,β2 分布在腦、軟骨、表皮和心臟,β3 存在于腦、表皮、肺、軟骨。 β亞基主要功能為輔助新合成的α 亞基正確折疊、靶向和插入到細胞膜[3],并穩(wěn)定α 亞基構(gòu)型及調(diào)節(jié)其活性[7]。 FXYD 蛋白家族為7 個單個跨膜區(qū)段伴或不伴信號肽的短多肽,分為FXYD1-7,具有組織特異性表達,在腦組織主要表達FXYD1、FXYD6、FXYD7,通過調(diào)節(jié)NKA 與底物的親和力及其最大反應(yīng)速度來發(fā)揮作用[8]。

2 NKA 與癲癇的關(guān)系

多方面的證據(jù)顯示NKA 與癲癇密切相關(guān),尤其是NKA 活性變化與癲癇發(fā)作互為因果。 一方面,癲癇發(fā)作可導致NKA 活性下降。 動物發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)后NKA 活性下降[9-11],癲癇患者腦組織內(nèi)NKA 活性也顯著降低[12]；另一方面,NKA 活性改變也可能引發(fā)癲癇。 Atp1a2 突變鼠的癲癇易感性升高[13-14]；通過雜交技術(shù)敲除Atp1a3 基因的胎鼠在圍生期出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作[15]；在小鼠敲入E815k 或D801n 使NKAα3 功能障礙后,出現(xiàn)自發(fā)的癲癇發(fā)作[16-17]；此外,已在癲癇患者發(fā)現(xiàn)有ATP1A3 單基因突變[17-19]。 Atp1a3 或ATP1A3 突變可導致NKA 活性降低,進而導致膜去極化,神經(jīng)元興奮性增加[17,20-21],且敲入D801y 導致α3 表達量異常,導致癲癇發(fā)作閾值下降[21]。

然而,如果提高NKA 活性是否就減少癲癇發(fā)作或降低易感性呢? Funck 等[9-10]首先采用NKA 激動劑DRRSAb 使發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)后小鼠海馬組織中降低的NKA 活性恢復(fù)正常,再予戊四氮點燃,發(fā)現(xiàn)實驗鼠的潛伏期明顯延長；然而,給正常小鼠使用DRRSAb 升高NKA 活性,再予戊四氮后小鼠癲癇發(fā)作加重。 因此,要抑制癲癇發(fā)作,僅能把NKA活性調(diào)控在一定范圍內(nèi),并非NKA 活性上調(diào)越高,對癲癇控制越好。

3 NKA 參與癲癇發(fā)病的機制

癲癇發(fā)作是由于腦內(nèi)神經(jīng)細胞的興奮性過高而抑制功能削弱所致,與離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)、能量代謝及神經(jīng)膠質(zhì)細胞異常密切相關(guān)。 NKA 不僅在腦內(nèi)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞表達,還參與調(diào)控神經(jīng)細胞離子轉(zhuǎn)運、重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的代謝,以及能量代謝等[22-23]。

3.1 NKA 與離子平衡

神經(jīng)元內(nèi)的NKA 通過利用水解ATP 釋放的能量維持細胞內(nèi)外電化學梯度來維持其興奮性。 抑制NKA 活性,將導致胞內(nèi)Na+增高,胞外K+蓄積,廣泛膜去極化,膜興奮性增加,癲癇發(fā)作[24]。 此外,NKA 所形成的Na+、K+濃度差又可誘發(fā)Ca2+、Cl-、H+、谷氨酸、GABA 以及葡萄糖等轉(zhuǎn)運[25]。 因此,NKA 激活后可產(chǎn)生神經(jīng)元動作電位后超極化電流,而導致癲癇發(fā)作終止或癲癇易感性下降[26]。

3.2 NKA 與谷氨酸代謝

谷氨酸是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),谷氨酸在興奮性突觸中的轉(zhuǎn)運依賴于谷氨酸轉(zhuǎn)運體(excitatory amino acid transporters, EAATs)。 EAATS利用NKA 所形成的鈉鉀電化學梯度作為驅(qū)動力[25],每轉(zhuǎn)運入1 分子谷氨酸的同時,伴隨1 分子K+排出到胞外和3 分子Na+、1 分子H+進入到胞內(nèi)。胞內(nèi)Na+濃度升高,激活NKA,其中EAAT1、EAAT2特異性表達在星形膠質(zhì)細胞,而其余EAATS 表達在神經(jīng)元上[27]。 當NKA 功能障礙時,可導致谷氨酸清除障礙,甚至反向轉(zhuǎn)運出胞外。 生理情況下,谷氨酸轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)后,在星形膠質(zhì)細胞表達的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺,而GS 活性同樣受胞內(nèi)Na+濃度調(diào)控[25]；生成的谷氨酰胺在分布于星形膠質(zhì)細胞的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體(system N transporter 1,SN1)作用下進入細胞外空間,而SN1 轉(zhuǎn)運谷氨酰胺的方向由Na+電化學梯度和谷氨酰胺的濃度差決定。 在細胞外空間的谷氨酰胺由谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體SAT1(system A type glutamine transporter 1)、 STA2 ( system A type glutamine transporter 2)分別轉(zhuǎn)運至GABA 能和谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi)。 谷氨酰胺在神經(jīng)元內(nèi)轉(zhuǎn)化為谷氨酸。 在谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi)谷氨酸被囊泡轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運入囊泡儲存。 因此,當NKA 活性下調(diào)后,胞內(nèi)Na+蓄積,谷氨酸釋放增加,谷氨酸清除減少,胞外谷氨酸蓄積[28]。

神經(jīng)元釋放谷氨酸的主要方式具有鈣依賴性。靜息狀態(tài)下,神經(jīng)元外Ca2+濃度約為細胞內(nèi)的1 萬倍,而要維持這種Ca2+胞內(nèi)外濃度差除經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣泵、線粒體上Ca2+單向轉(zhuǎn)運體將鈣回收入鈣庫外,Ca2+運出胞外還主要涉及質(zhì)膜鈉/鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger； NCX)與質(zhì)膜鈣泵這兩個方式。 前者負責主要Ca2+大量外排,后者負責Ca2+外排細微調(diào)節(jié)。 NCX 存在兩種工作模式,正向模式是NCX利用Na+濃度梯度作為驅(qū)動力,3 個Na+進入胞內(nèi)的同時將一個鈣離子轉(zhuǎn)運出胞外[29]；反之為逆向模式。 NCX 正向模式依賴于NKA 的鈉鉀電化學梯度,當NKA 活性異常時,可導致鈉鈣交換效率下降,甚至逆轉(zhuǎn)為反向模式[30],胞內(nèi)Ca2+蓄積[31],觸發(fā)突觸谷氨酸大量釋放,胞外谷氨酸蓄積。 胞內(nèi)Ca2+過多,可抑制α2、α3 型NKA 活性,而NKA 活性下降或喪失可導致胞內(nèi)Ca2+蓄積,形成一個正反饋機制[32]。

3.3 NKA 與GABA 代謝

GABA 是哺乳動物腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA 能神經(jīng)元的谷氨酰胺在谷氨酰胺酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?在谷氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚ABA,并在囊泡轉(zhuǎn)運體作用轉(zhuǎn)運入囊泡,當GABA能神經(jīng)元轉(zhuǎn)去極化,GABA 釋放至細胞外空間,星形膠質(zhì)細胞上特異性表達3 型GABA 轉(zhuǎn)運體[33](GABA transporters 3,GAT3),GAT3 活動依賴Na+濃度梯度,而經(jīng)GAT3 轉(zhuǎn)運入星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的GABA 進入三羧酸循環(huán)進而轉(zhuǎn)化為谷氨酸。 谷氨酸為GABA 氨基酸合成的前體,當NKA 活性異常導致GABA 合成減少或轉(zhuǎn)運異常,導致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性活動相對亢進。

3.4 NKA 與能量代謝

葡萄糖為大腦能量主要來源[34]。 NKA 參與腦組織中葡萄糖代謝。 在腦細胞內(nèi)的葡萄糖在己糖激酶作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸,此后有三條代謝途徑:糖酵解后生成丙酮酸進入線粒體三羧酸循環(huán)氧化供能或在乳酸脫氫酶作用下還原為乳酸；磷酸戊糖途徑；生成糖原。 神經(jīng)元釋放谷氨酸,星形膠質(zhì)細胞清除谷氨酸,細胞內(nèi)Na+濃度升高,激活NKA,ATP 消耗增加,激活星形膠質(zhì)細胞上表達的葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(glucose transporters1,GLUT1)進而循環(huán)中攝取葡萄糖、糖酵解增加[35-36],乳酸生成增加； 乳酸在單羧酸轉(zhuǎn)運體( monocarboxylate transporters,MCTs)作用下進入神經(jīng)元,單羧酸轉(zhuǎn)運體的亞型MCT1、MCT4 主要在星形膠質(zhì)細胞中表達,而MCT2 主要分布于神經(jīng)元上,且MCTs 的功能受胞內(nèi)Na+濃度調(diào)控[25]；隨后乳酸進入在線粒體中經(jīng)過三羧酸循環(huán)氧化,產(chǎn)生更多的ATP。 在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)表達有ATP 敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels, KATP),當ATP 水平升高時,KATP 通道關(guān)閉,組織K+進入胞內(nèi),從而促進膜去極化和神經(jīng)元電活動[36]。 而當NKA 功能異常時可能影響葡萄糖轉(zhuǎn)運、乳酸穿梭、KATP 等,導致膜去極化或產(chǎn)生動作電位,進而影響癲癇發(fā)生或易感性。 研究表明,耐藥性癲癇患者和小鼠癲癇模型中均存在葡萄糖低代謝表現(xiàn)[37-38]。 Freitas 等[39]研究顯示,在體內(nèi)外,利用匹羅卡品小鼠癲癇模型證明NKA 活性降低可導致谷氨酸釋放增加、葡萄糖低代謝,恢復(fù)NKA 活性可維持谷氨酸正常水平、恢復(fù)葡萄糖代謝。 葡萄糖低代謝還與癲癇腦內(nèi)神經(jīng)元重塑、異常網(wǎng)絡(luò)形成相關(guān)[38],能量代謝異?？捎绊戇f質(zhì)傳遞和癲癇發(fā)作和擴散[40]。

此外,NKA 親和性下降,可能導致能量供應(yīng)不足或ATP 蓄積而影響KATP。 Smeland 等[41]發(fā)現(xiàn)在顳葉癲癇小鼠中,線粒體能量代謝障礙可加劇海馬NKA 與ATP 親和力下降。 Funck 等[9]發(fā)現(xiàn)α2/3 亞型ATP 酶對癲癇小鼠海馬中ATP 的親和力降低。

3.5 Calponin-3

Calponin-3 是 由 CNN3 基 因 編 碼[42]。 Han等[43]發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患者及癲癇鼠海馬組織中calponin-3 表達量均明顯增加。 Calponin 與肌動蛋白結(jié)合可抑制ATP 酶活性[42-44], 而大腦中的NKA又是神經(jīng)元興奮性的主要調(diào)節(jié)因子,calponin-3 在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞中均有表達。 因此,calponin-3有可能通過抑制NKA 活性來調(diào)控癲癇易感性,潛在機制需進一步研究。

4 癲癇相關(guān)的ATP 酶活性調(diào)控機制

NKA 活性調(diào)節(jié)有很多方式,如遺傳突變、磷酸化/去磷酸化、硝基化、激動劑/抑制劑等。

4.1 遺傳突變

大部分基因突變可導致NKA 功能改變或喪失。Myshkin 小鼠Atp1a3 的I810n 突變、Mashl 小鼠Atp1a3 的D801n 突變均可導致α3 亞型NKA 活性失活[45]。 但有些基因突變可導致NKA 穩(wěn)定性改變、表達水平下降或膜靶向缺陷。 如NKA 與錨蛋白B、小窩蛋白1 相互作用基序突變可導致NKA 膜靶向改變[46]。

4.2 磷酸化/去磷酸化

磷酸化是指在蛋白激酶作用下,蛋白質(zhì)氨基酸的羥基被磷酸基團取代；反之為去磷酸化。 NKA 活性受磷酸化/去磷酸化修飾,Marquezan 等[47]發(fā)現(xiàn)在戊四氮誘導小鼠癲癇發(fā)作NKAα 亞基Ser943 的磷酸化顯著增加,其活性下降。 而Mallick 等[48]研究表明,NKA 去磷酸化可導致酶活性增加。

4.3 硝基化

硝基化是指向有機物中引入硝基的過程。 NKA的硝基化可能調(diào)控其活性(此過程不可逆)。 Ryan等[49]研究顯示在海仁酸誘導的SE 后6 周,大鼠海馬神經(jīng)元中的NKA 總酶硝基化逐漸增加。 Funck等[9]在匹羅卡品誘導的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE)后2 個月,NKA 的硝基化水平升高,導致NKA 活性下降。 但SE 可能會出現(xiàn)大腦缺血缺氧狀態(tài),而在新生兒缺血缺氧性腦病中也觀察到NKAα3 亞基硝化水平顯著上升[50-51]。 因此,硝基化對于酶影響是否可導致癲癇尚且存在爭議。

4.4 激動劑與抑制劑

哇巴因特異性作用于NKAα 亞基上發(fā)揮抑制作用。 在人類中,哇巴因與三種NKAα 亞型親和力相近[52]。 在嚙齒類動物中,哇巴因與各亞型的親和力差異較大:與α3 亞型親和力最高,α2 次之,α3 親和力最低[53-54]。 哇巴因可抑制NKA 活性導致癲癇發(fā)生[55]；DRRsb 可激活NKAα3 亞型進而降低癲癇易感性[10]；有些藥物為劑量依賴性,低劑量發(fā)揮激動作用,高劑量則轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?如艾地苯醌、南天竹非堿[56-57]；一些兒茶酚胺類對NKA 活性具有調(diào)節(jié)作用,如:芬普雷司能增加突觸間隙的去甲腎上腺素和多巴胺,有趣的是芬普雷司能在腦紋狀體增加NKA 活性,而在丘腦內(nèi)卻是使NKA 活性降低[58],其機制可能是通過作用于α1 A 腎上腺受體使NKA 去磷酸[48]。

5 總結(jié)與展望

NKA 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性具有調(diào)節(jié)作用,NKA 活性的改變可導致神經(jīng)細胞膜電位不穩(wěn)、胞內(nèi)鈉鈣蓄積、胞外鉀清除障礙、神經(jīng)遞質(zhì)攝取釋放異常及能量代謝障礙。 NKA 活性可能在一定范圍內(nèi)抑制癲癇發(fā)作,為癲癇治療潛在靶點,值得進一步研究。