崔雨沙,路 欣,李 峰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2016 級(jí)五年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系,北京腦重大疾病研究院,北京神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種年齡相關(guān)的的神經(jīng)退行性疾病,組織學(xué)表現(xiàn)為Aβ斑塊沉淀以及神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)炎癥的形成[1]。AD 患者危險(xiǎn)基因位點(diǎn)很大一部分位于小膠質(zhì)細(xì)胞[2],如Trem2、Apoe 等；而小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦主要的免疫細(xì)胞,與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生息息相關(guān)。以往對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的研究大多采用M1、M2 分型的方式對(duì)其功能進(jìn)行解釋[3]。 但隨著現(xiàn)在技術(shù)的進(jìn)步,如全基因組測(cè)序、表觀遺傳學(xué)分析等,我們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和疾病的認(rèn)識(shí)更加深入和全面,這一分型已經(jīng)不能滿足我們的需求。 利用單細(xì)胞測(cè)序等方法,從細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組角度,最近發(fā)現(xiàn)了一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞亞型——疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞(disease associated microglia,DAM),它在AD 晚期擔(dān)任著重要的保護(hù)作用,為AD 疾病的治療帶來(lái)了新的曙光。本文綜述了近年來(lái)小膠質(zhì)細(xì)胞在AD 發(fā)病中的研究進(jìn)展,特別從小膠質(zhì)細(xì)胞的分型進(jìn)行歸納總結(jié),以期對(duì)廣大研究工作者更多啟發(fā)。

1 小膠質(zhì)細(xì)胞在正常狀態(tài)和AD 疾病中的作用

小膠質(zhì)細(xì)胞大約占人類大腦所有細(xì)胞的0.5%到16.6%,是大腦中最主要的免疫細(xì)胞,起源于胚胎七到八天的原始骨髓祖細(xì)胞,由卵黃囊分化而來(lái),和循環(huán)系統(tǒng)的單核細(xì)胞相互獨(dú)立[4]。 正常狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞可以在沒(méi)有外周造血細(xì)胞輸入的情況下進(jìn)行自我更新并且保持固有數(shù)量[5]。 作為大腦中的免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞主要通過(guò)表面的受體不斷感受周邊的病原體、凋亡神經(jīng)元等刺激,從而做出相應(yīng)反應(yīng),起到維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能。它也有許多不同于吞噬細(xì)胞的功能,如修剪突觸、促進(jìn)神經(jīng)元再生、組織軸突的投射等[3],對(duì)于大腦的發(fā)育至關(guān)重要。 AD 疾病狀態(tài)時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞主要有兩方面的作用,一方面參與炎癥反應(yīng),在Aβ 刺激下使NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子活化,從而引起一系列炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生炎癥因子如IL-1β、TNFα[6]等,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；另一方面小膠質(zhì)細(xì)胞可以介導(dǎo)Aβ 的吞噬,減少Aβ 沉積[7],還可以通過(guò)Trem2 形成小膠質(zhì)細(xì)胞屏障[8],最終減少Aβ 對(duì)AD 病人的危害,延緩病情發(fā)展。 隨著疾病的分期不同,小膠質(zhì)細(xì)胞起的作用亦不相同。 AD 的疾病病程主要可以被分為三期,AD 初期為Aβ 斑塊的形成期,這一期小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)炎癥小體NLRP3 中的ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)來(lái)協(xié)助Aβ 蛋白聚集以及在大腦中播散,并且產(chǎn)生一些炎癥因子來(lái)促進(jìn)Aβ 斑塊的形成,因此在這一期的炎癥反應(yīng)主要為有害的作用；AD 中期為Aβ 斑塊沉積期,這一期Aβ 斑塊增加,小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)Trem2 介導(dǎo)形成小膠質(zhì)細(xì)胞屏障來(lái)抑制Aβ 斑塊的擴(kuò)散,防止其毒害周圍的神經(jīng)元,起著神經(jīng)保護(hù)性的作用；AD 末期為T(mén)AU 蛋白沉積、Aβ 蛋白達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)期,這一期神經(jīng)元的死亡增加,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在清除死亡神經(jīng)元的過(guò)程中誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,造成更多神經(jīng)元的死亡,形成一個(gè)惡性循壞[9]。

2 傳統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞分型——M1、M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞

為了解釋小膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜功能,傳統(tǒng)觀念把小膠質(zhì)細(xì)胞分為M1、M2 兩型,而這一分型最初是從外周吞噬細(xì)胞分型借用來(lái)的。 研究者們發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞在T 細(xì)胞分泌的兩種炎癥因子IFNγ 和IL-4的誘導(dǎo)下,會(huì)產(chǎn)生兩種完全不同的細(xì)胞表型:M1 和M2 型,它們的表面標(biāo)志物以及功能都不相同,反映了吞噬細(xì)胞在多種免疫環(huán)境下可以產(chǎn)生不同的表型來(lái)發(fā)揮作用。 但小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦特有的免疫細(xì)胞,它的來(lái)源、生存環(huán)境、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及所發(fā)揮的作用都和吞噬細(xì)胞不一致,因此,簡(jiǎn)單地把吞噬細(xì)胞分型引入到小膠質(zhì)細(xì)胞是不科學(xué)的。 為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn),我們使用單細(xì)胞RNA 測(cè)序的方法去分析腦部創(chuàng)傷模型小鼠大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果確實(shí)無(wú)法找到只表達(dá)M1 型或M2 型標(biāo)志基因的小膠質(zhì)細(xì)胞[3]。 所以,M1、M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞并沒(méi)有轉(zhuǎn)錄譜以及其他科學(xué)依據(jù)的支持,這一分型的合理性值得懷疑。 為了克服其局限性,我們需要尋找一個(gè)新的、合理的小膠質(zhì)細(xì)胞分型,來(lái)指導(dǎo)我們接下來(lái)的道路。

3 一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞類型——疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞

脫離原有利用細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分型的思路,最近的單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)幫助我們客觀地認(rèn)識(shí)免疫細(xì)胞的類型及其狀態(tài),提供了一個(gè)從轉(zhuǎn)錄組方面定義細(xì)胞類型的新工具。 利用此方法,2017 年Keren-Shaul 等[10]發(fā)表的文獻(xiàn)介紹了在阿爾茲海默癥5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的一種AD 小鼠特有的小膠質(zhì)細(xì)胞——疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM),它在這一疾病模型的病理晚期特異性的出現(xiàn)而不在野生型小鼠中出現(xiàn),主要標(biāo)志物為CD9、CD11、Clec7a 和CD63,定位于Aβ 斑塊附近。Keren-Shaul 等[10]的研究發(fā)現(xiàn),與穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞相比,DAM 有著截然不同的基因型,出現(xiàn)一些基因的下調(diào)如Cx3cr1；也有一些基因的上調(diào)如Apoe、Lpl、CD9、Cst7、Trem2,是一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞類型。DAM 高表達(dá)脂代謝和吞噬相關(guān)基因,可以吞噬Aβ蛋白,幫助大腦清除Aβ 沉積,起保護(hù)性作用。 但在AD 后期,由于Aβ 活化了炎癥小體,而炎癥小體的ASC 可以協(xié)助Aβ 斑塊的沉積[10],DAM 反而會(huì)加速病情發(fā)展。 除5XFAD 小鼠,在其他神經(jīng)退行性病變小鼠模型如ALS、APP 小鼠也有DAM 的存在[11],但這些DAM 是否為同一種小膠質(zhì)細(xì)胞,還需要進(jìn)一步的探究。

DAM 主要由凋亡的神經(jīng)元和髓鞘碎片等誘導(dǎo)產(chǎn)生,磷脂酰絲氨酸為DAM 識(shí)別凋亡細(xì)胞的靶點(diǎn)[12]。 這些可以誘導(dǎo)DAM 產(chǎn)生的物質(zhì),有學(xué)者把它 們 稱 為 神 經(jīng) 變 性 相 關(guān) 分 子 模 式( neurodegeneration-associated molecular patterns,NAMP),類似于外周誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞活化的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),包括死亡神經(jīng)細(xì)胞凋亡體、髓鞘碎片、脂類降解產(chǎn)物、神經(jīng)退行性疾病和衰老所形成的細(xì)胞外蛋白聚集(如Aβ)等。 識(shí)別NAMP 需要DAM 上相應(yīng)的受體,如Trem2、TAM(Tyro3/Axl/Mer)、嘌呤受體P2Y12,它們分別介導(dǎo)不同的功能[13]。 對(duì)于這些受體的深入研究,可以幫助我們更好的理解DAM在AD 及其他神經(jīng)退行性病變中的作用。

3.1 DAM 的分型

小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中的作用是多方面的,疾病晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞亦然。 Rangaraju等[14]2018 年發(fā)表的文獻(xiàn)以CD11b 為主要標(biāo)志物篩選疾病晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞,然后通過(guò)整合小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集和驗(yàn)證研究,發(fā)現(xiàn)了促炎和抗炎兩類小膠質(zhì)細(xì)胞。 其中抗炎的小膠質(zhì)細(xì)胞以CD44、CD45 和CD274 為標(biāo)志,主要富集參與碳水化合物和脂質(zhì)代謝、膽固醇外排、抗原呈遞、氧化還原酶活性和衰老/自噬的胞漿蛋白相關(guān)基因,可以被NFkB、Stat1、P53 和RelA 調(diào)控；促炎的小膠質(zhì)細(xì)胞以CXCR4 為標(biāo)志,主要富集促炎功能相關(guān)基因,包括免疫信號(hào)、細(xì)胞增殖、粘附、抗原呈遞、鈣內(nèi)流和細(xì)胞因子的產(chǎn)生等,可以被LXRα/β 和Atf-1 調(diào)控。這兩類小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)DAM 的特征基因,在阿爾茲海默癥5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠分離的DAM 中,也可以根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志找到這兩類小膠質(zhì)細(xì)胞,因此,這兩類小膠質(zhì)細(xì)胞為DAM 的兩個(gè)亞型,分別命名為促炎DAM 和抗炎DAM。 這兩個(gè)DAM 亞型均在Trem2 的下游出現(xiàn),抑制Trem2 后便不會(huì)產(chǎn)生這兩種小膠質(zhì)細(xì)胞亞型[14]。

但是DAM 為病理晚期出現(xiàn)的小膠質(zhì)細(xì)胞類型,無(wú)法解釋小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組隨著時(shí)間是如何變化的。 為了探查不同疾病時(shí)期小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組,Mathys 等[15]的研究對(duì)AD 小鼠模型不同病理階段的小膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行了單細(xì)胞RNA 測(cè)序及分析。 文獻(xiàn)結(jié)果表明在病理早期的小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)DNA 復(fù)制和修復(fù)以及細(xì)胞周期相關(guān)的基因,其上調(diào)的基因主要與細(xì)胞增殖分裂相關(guān),小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性病變中的增殖反應(yīng)主要在這一階段完成；而病理晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)的基因主要為免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。 病理晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞按照轉(zhuǎn)錄組的不同又可以分為兩類,一類為1 型干擾素誘導(dǎo)的基因模塊,調(diào)控抗病毒和干擾素應(yīng)答反應(yīng),主要與神經(jīng)元的DNA 損傷有關(guān),神經(jīng)元DNA 的損傷可以誘導(dǎo)出此類小膠質(zhì)細(xì)胞；一類為2 型干擾素誘導(dǎo)的MHC II 類基因模塊,主要以T 細(xì)胞非依賴的方式發(fā)揮作用,可以放大神經(jīng)退行性病變的癥狀[15]。 比較這一分型中病理早期小膠質(zhì)細(xì)胞與DAM 基因的異同,發(fā)現(xiàn)病理早期小膠質(zhì)細(xì)胞的基因與DAM 相似性不高。 而病理晚期小膠質(zhì)細(xì)胞基因變化與DAM 大致相同:在DAM 上調(diào)的278 個(gè)基因中,202 個(gè)都在病理晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)。 但是許多抗病毒和干擾素反應(yīng)相關(guān)的基因在病理晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)而不在DAM 中上調(diào)[15]。 關(guān)于病理晚期的小膠質(zhì)細(xì)胞在疾病中是起一個(gè)保護(hù)性還是傷害性或中立性的作用,目前還不清楚,需要進(jìn)一步的探究。

3.2 DAM 相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)

3.2.1 Trem2 和DAM

Trem2 是AD 的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)基因,基于單細(xì)胞測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn),Trem2 可以決定DAM 表型的出現(xiàn)。穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)兩步變?yōu)镈AM:第一步為不依賴于Trem2 的過(guò)程,在這一步穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)卡基因如Cx3cr1 和P2ry12/P2ry13 下調(diào),而一些AD相關(guān)的基因如B2m、Apoe 上調(diào),小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g態(tài)DAM；第二步為依賴Trem2 的過(guò)程,小膠質(zhì)細(xì)胞Trem2 高表達(dá),吞噬和脂代謝相關(guān)的基因如Cst7 和Lpl 高表達(dá),轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K的DAM[16]。 關(guān)于Trem2 介導(dǎo)DAM 轉(zhuǎn)型的具體機(jī)制,有研究發(fā)現(xiàn)Trem2 可以通過(guò)激活mTOR 通路來(lái)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。 如果敲除Trem2,mTOR 會(huì)被抑制,而長(zhǎng)期的mTOR 缺陷會(huì)導(dǎo)致整體小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞存活率和增殖率降低。 因此Trem2 可能是通過(guò)維持第一步活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)以及生存狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)第二步的轉(zhuǎn)變的[17],而不是通過(guò)介導(dǎo)一種新的基因型的變化。

3.2.2 APOE 和DAM

APOE 是一種能夠結(jié)合和運(yùn)輸膽固醇以及脂質(zhì)的蛋白,在人類有APOE2、APOE3、APOE4 三種亞型。 其中APOE4 的純合子可以使AD 的發(fā)病率提高12 倍；APOE2 則可以延遲遺傳性AD 的發(fā)病年齡；APOE3 與AD 發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。 APOE 在穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量很低,但在DAM 中APOE表達(dá)卻大幅增加,是DAM 中表達(dá)量上調(diào)幅度最大的基因之一。 用凋亡的神經(jīng)元去激活小膠質(zhì)細(xì)胞,可以通過(guò)Trem2 誘導(dǎo)出APOE 的活化,進(jìn)而調(diào)控APP-PS1 和SOD1 小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)換,使小膠質(zhì)細(xì)胞向DAM 的方向轉(zhuǎn)變,形成促進(jìn)DAM轉(zhuǎn)型的Trem2-APOE 軸；若把APOE 或Trem2 敲除,小膠質(zhì)細(xì)胞便不會(huì)向DAM 方向轉(zhuǎn)變[18]。 從亞型的層面研究APOE,發(fā)現(xiàn)APOE4 的表達(dá)可以使小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于受傷的神經(jīng)元有更高的攻擊性,促進(jìn)靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镈AM,所以在TREM2-APOE軸起主要作用的APOE 亞型可能為APOE4[19]。

3.2.3 IRF1、LXRβ 和CEBPα

在促炎和抗炎DAM 發(fā)現(xiàn)之后,有研究對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,確定了幾個(gè)可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄因子,分別為CEBPα、IRF1 和LXRβ。 CEBPα、IRF1 和LXRβ 都可以調(diào)節(jié)DAM 的核心基因如Apoe、Axl、Clec7a、Tyrobp 和Trem2,很大程度上決定了穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞向DAM 的轉(zhuǎn)型。 其中IRF1 調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞、促炎DAM、抗炎DAM 三個(gè)模塊的基因,在小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)中起雙重作用；CEBPα 和LXRβ 則主要調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞和抗炎DAM 的基因,起保護(hù)作用。 除了調(diào)節(jié)促炎和抗炎DAM 表型,CEBPα、IRF1 和LXRβ 還可以下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元突觸修剪相關(guān)的基因,而IRF1 和LXRβ 可以上調(diào)吞噬相關(guān)的基因,增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ 的吞噬,因此IRF1 和LXRβ 可能通過(guò)介導(dǎo)從穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的突觸修剪功能向AD 的吞噬清除功能的轉(zhuǎn)變,來(lái)促進(jìn)促炎DAM 表型的生成[20]。

3.2.4 其他DAM 危險(xiǎn)基因

除上述位點(diǎn)外,還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多其他與DAM相關(guān)的危險(xiǎn)位點(diǎn)。 (1)CD33 和TYROBP/DAP12 分別為T(mén)rem2 上游和下游的分子,且在DAM 中表達(dá)量大幅增加[14]。 (2)膜受體ABCA7、Tyro3/Axl/Mer(TAM)、CX3CR1 與P2Y12 等分別可以結(jié)合Aβ 蛋白、凋亡神經(jīng)元、補(bǔ)體與細(xì)胞外ADP 等,對(duì)于DAM的功能至關(guān)重要。 (3)細(xì)胞激酶RIPK1 可以介導(dǎo)一部分小膠質(zhì)細(xì)胞的基因變化,促使小膠質(zhì)細(xì)胞向DAM 的轉(zhuǎn)型[21]。 (4)基因分析發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)節(jié)DAM 表型的基因,其中Apoe, Hla-dqa1 可以促進(jìn)促炎DAM 的表達(dá)；Ms4a4e, Hla-dqb1 和Treml2 促進(jìn)抗炎DAM 表達(dá)；Bin1, Cnn2,Picalm 和Sorl1 促進(jìn)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)[14]。 (5)許多基因的變異可以增加疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)如TYROBP、GRN 等,另一些基因如MS4A6A、PLCG2、PICALM 等的變異則可以對(duì)疾病起保護(hù)性作用,而這些基因都與DAM有很強(qiáng)的相關(guān)性,在DAM 中的表達(dá)量與穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞相比差異顯著[13]。

4 研究展望

顯然,從轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行全面分析,構(gòu)建小膠質(zhì)細(xì)胞分型可以擺脫傳統(tǒng)細(xì)胞分型的局限,更加全面和科學(xué)的認(rèn)識(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞在疾病中的作用。 但這一分型體系研究仍在初始階段,對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞在不同時(shí)期是如何被誘導(dǎo)為特異的亞型、不同亞型的小膠質(zhì)細(xì)胞所承擔(dān)的具體作用,以及這些分型中所預(yù)測(cè)到的AD 危險(xiǎn)位點(diǎn)所介導(dǎo)的作用都尚未清楚,因此,關(guān)于DAM 的相關(guān)研究仍需深入,以期對(duì)AD 開(kāi)辟新的診治思路。