向科臻 陳亮 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

人牙硬組織的形成是典型的生物礦化過程，即在有機(jī)基質(zhì)模板誘導(dǎo)下的晶體的成核、生長、聚集以及取向[1-2]?；诖恕坝袡C(jī)基質(zhì)調(diào)控理論”，在近年來仿生礦化的研究中，人們逐漸認(rèn)識到有機(jī)大分子是生物礦化和仿生合成的核心，生物材料的分子仿生設(shè)計(jì)也隨之成為了現(xiàn)代硬組織修復(fù)材料設(shè)計(jì)的主導(dǎo)思想。采用有機(jī)模板誘導(dǎo)牙體組織仿生礦化的主要過程如下：先形成有機(jī)物的自組裝體作為礦化模板，隨后無機(jī)先驅(qū)物在自組裝聚集體與溶液相的界面處發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，再由有機(jī)模板調(diào)控?zé)o機(jī)晶體的成核、生長、取向、形態(tài)、大小和顯微結(jié)構(gòu)[3-4]。仿生礦化的關(guān)鍵是尋找可誘導(dǎo)和調(diào)控晶體形成與生長的有機(jī)物模板，盡管提取天然釉原蛋白用于人牙釉質(zhì)表面再礦化的效果值得肯定，但人體內(nèi)的礦化基質(zhì)提取成本較高且容易受pH值、氟濃度等環(huán)境改變影響[5]，因此是否能發(fā)現(xiàn)或合成與之功能相仿的人工替代物成為了近年來的研究熱點(diǎn)[6]。

聚酰胺—胺樹枝狀聚合物（polyamidoaminedendrimer，PAMAM）就是其中之一，其具有天然非膠原蛋白相似的形態(tài)和功能特點(diǎn)，被稱之為“人工蛋白”[7]。20世紀(jì)80年代初，Tomalia等[8]通過反復(fù)加成反應(yīng)首次發(fā)明合成了PAMAM（以乙二胺或氨為引發(fā)核，聚合反應(yīng)由引發(fā)核向外逐級發(fā)生）。PAMAM不僅具有三維結(jié)構(gòu)、高度支化、分子內(nèi)部空腔和表面基團(tuán)易于改性等特點(diǎn)，還具有良好的生物相容性、低毒性和無免疫源性，是目前研究最為廣泛的樹枝狀聚合物之一[9-10]。這些特點(diǎn)使PAMAM可以被用作仿生大分子，模擬天然有機(jī)基質(zhì)在牙體組織表面進(jìn)行仿生礦化，即PAMAM作為有機(jī)模板調(diào)控礦物質(zhì)成核以及晶體的生長，以此來建造比傳統(tǒng)的異體材料更加理想的牙體修復(fù)材料。已有越來越多的研究開始將PAMAM應(yīng)用到牙體硬組織仿生礦化中，并取得了值得關(guān)注的結(jié)果。本文旨在對近年來PAMAM在牙科方向上仿生礦化的研究進(jìn)行綜述，為今后的研究工作墊定基礎(chǔ)。

1 PAMAM與牙體硬組織仿生再礦化

PAMAM在模擬生物礦化方面有巨大潛能，然而其在牙體硬組織仿生礦化中的作用機(jī)制尚不明確。推測牙本質(zhì)脫礦導(dǎo)致膠原-COOH末端暴露在空氣中，隨后在肽鍵凝聚劑作用下，裸露的-COOH末端與PAMAM的-NH2端結(jié)合，形成酰胺鍵（-CO-NH-）接枝有機(jī)蛋白，成為仿生礦化的有機(jī)控制模板。

Jia等[11]通過掃描電子顯微鏡觀察到，脫礦牙本質(zhì)經(jīng)第4.0代PAMAM（G4-PAMAM）處理后的超微結(jié)構(gòu)改變，礦化液中浸泡8周后，牙本質(zhì)管口被一層扁平、環(huán)形的晶狀沉積覆蓋，部分阻塞了牙本質(zhì)小管，與去離子水處理的空白組相比，PAMAM組小管的直徑和數(shù)目均顯著減少，意味著可減緩牙本質(zhì)內(nèi)液體的快速流動(dòng)。G4-PAMAM具有治療牙本質(zhì)過敏癥的潛在價(jià)值[11-13]。林軒東[14]通過Pramanik水化學(xué)反應(yīng)制備的聚酰胺-胺/納米羥磷灰石（polyamideamine/nano-hydroxyapatite，PAMAM/n-HAP）納米復(fù)合生物材料，也具有同樣作用。盡管PAMAM誘導(dǎo)牙本質(zhì)小管封閉速率慢于脫敏劑中常用的NaF，但在28 d后獲得了同樣效果，且具有更強(qiáng)的耐酸性，意味著其后期封閉效果更加穩(wěn)定[15]。

PAMAM的再礦化作用不僅可用于治療牙本質(zhì)過敏癥，還可以用于齲壞、酸蝕、機(jī)械作用等原因?qū)е碌娜睋p牙體的修復(fù)， Zhou等[16]探討了三氯生負(fù)載的PAMAM-COOH樹狀大分子在人牙本質(zhì)上的應(yīng)用，結(jié)果顯示PAMAM不僅能夠作為藥物載體吸附于牙本質(zhì)表面，而且在局部釋放抗菌藥物的同時(shí)可作為仿生礦化的有機(jī)模板劑修復(fù)損傷牙本質(zhì)，該結(jié)果提示了PAMAM在齲病修復(fù)材料方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。

以PAMAM為模板研究牙體硬組織仿生礦化的過程中，改性后的PAMAM具有的多功能性逐漸引起了學(xué)者關(guān)注。雖然近年來越來越多的研究證實(shí)了在代數(shù)、表面基團(tuán)、濃度以及作用時(shí)間等條件差異下， PAMAM始終在牙體硬組織表面具有形成晶體修復(fù)層的能力，并給出了一定的解釋及推測，但由于HAP礦物晶體的成核和結(jié)晶過程非常復(fù)雜，因此該影響機(jī)制還未有明確且公認(rèn)的解釋。

學(xué)者[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶不同官能團(tuán)的PAMAM，如端羧基PAMAM（PAMAM-COOH）、端羥基 PAMAM（PAMAM-OH）、端氨基 PAMAM（PAMAMNH2）均可吸收牙本質(zhì)膠原纖維中的 Ca、P離子并作為牙本質(zhì)仿生礦化模板，掃描電子顯微鏡觀察到經(jīng)過14 d人工唾液浸泡后，G3-PAMAM-COOH處理的牙本質(zhì)纖維表面清晰可見無定形磷酸鈣納米球，G4-PAMAM-COOH處理的牙本質(zhì)形成“玉米芯”狀外觀，至28 d時(shí)牙本質(zhì)表面覆蓋新生礦物，小管幾乎完全被阻塞，證明牙本質(zhì)纖維間、纖維內(nèi)有大量礦物質(zhì)沉積；與之相比，去離子水處理的空白組牙本質(zhì)管內(nèi)、外均無明顯礦化，管周膠原纖維呈扁平狀，表明由于纖維內(nèi)礦物支持不足導(dǎo)致脫水收縮[2]。

釉質(zhì)與牙本質(zhì)雖然礦物組成相似，但釉質(zhì)中碳酸鹽含量更低（約為3%），因而釉質(zhì)晶體體積大，孔隙度低，耐酸性較好[19]。目前鮮少有報(bào)道將PAMAM用于釉質(zhì)的仿生礦化。Zhang等[20]通過G4.5-PAMAMCOOH在人牙釉質(zhì)中的實(shí)驗(yàn)形成了定向良好且類似于釉柱的棒狀晶體，其自組裝過程與釉原蛋白相似，即納米球-鏈-微帶結(jié)構(gòu)[21]，并通過人牙釉質(zhì)在體外以及小鼠口腔環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)磷酸端PAMAM（PAMAM-PO3H2）也有同樣作用，且再生礦物層的厚度均大于10 μm。磷酸基團(tuán)與羧基基團(tuán)相比，不僅對Ca離子有更強(qiáng)的絡(luò)合能力，與羥磷灰石（hydroxyapatite，HAP）結(jié)合能力也更強(qiáng)[22]，推測其原因?yàn)榱姿岫?PAMAM 和牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）相似度更高，磷蛋白不僅是牙本質(zhì)基質(zhì)中最豐富的非膠原蛋白，且磷蛋白的磷酸化程度可以調(diào)控其與HAP的相互作用，進(jìn)而對HAP的成核和生長產(chǎn)生不同程度的作用[23]。Zhu等[24]用磷酸端基的PAMAM負(fù)載芹菜素成功誘導(dǎo)牙本質(zhì)仿生礦化的同時(shí)，對變異鏈球菌也起到了明顯的抗菌作用，該策略為臨床抗齲修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供了思路。

2 PAMAM復(fù)合材料在牙體硬組織仿生修復(fù)中的研究

近年來與PAMAM有關(guān)的生物復(fù)合材料因同時(shí)具有有機(jī)材料和無機(jī)材料的優(yōu)點(diǎn)而成為了牙體修復(fù)材料領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在更貼合實(shí)際口腔環(huán)境的循環(huán)人工唾液/乳酸模型中，PAMAM的仿生礦化效果比以往使用恒定pH值7的研究要弱得多[25]，之后研發(fā)出了PAMAM-無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，NACP）復(fù)合材料，認(rèn)為其有提供成核模板、酸中和、鈣磷離子釋放等三重好處，可實(shí)現(xiàn)促進(jìn)再礦化和預(yù)防脫礦的雙重效果，但隨著浸泡時(shí)間的增加，NACP釋放的鈣、磷逐漸減少，此外浸泡液的沖刷也可能洗掉PAMAM[26-27]。為了開發(fā)一種在流體沖擊下依然能維持長期再礦化的方法， Liang等[28]首先對涂布PAMAM的樣本進(jìn)行72 d的PBS浸泡和振蕩，建立了一個(gè)模擬口腔中受激作用超過1年的加速流體激發(fā)模型，然后用EBPMNACP復(fù)合材料（40%EBPM、40%NACP和20%玻璃顆粒，其中EBPM為一種二甲基丙烯酸酯和均苯四酸甘油的復(fù)合物）與涂布PAMAM后的脫礦牙本質(zhì)接觸并且經(jīng)過每日23 h人工唾液浸泡+1 h乳酸浸泡，如此持續(xù)35 d。值得矚目的是，新型EBPM-NACP復(fù)合材料的酸中和離子再釋放并沒有隨著反復(fù)“充電”和離子再釋放循環(huán)而降低，證明該復(fù)合材料可保持長期鈣磷離子釋放；且采用這種PAMAM+EBPMNACP策略下的樣本礦化程度幾乎恢復(fù)到了健康牙本質(zhì)水平。綜上所述，由于PAMAM和“可充電”的EBPM-NACP復(fù)合材料之間的協(xié)同作用，提供了流體沖擊下牙齒長期再礦化的可能性，也就意味著能夠?qū)ρ例X實(shí)施長效保護(hù)并抑制齲齒的發(fā)生。不僅如此，在pH=4的乳酸溶液環(huán)境中，G3-PAMAM-COOH與含NACP粘接劑的聯(lián)合應(yīng)用仍對牙本質(zhì)仿生礦化有顯著效果，提示其有希望解決牙齒仿生礦化方面口干癥和放射性齲這類患者酸性唾液環(huán)境且缺乏鈣、磷離子的問題[29]。

Ge等[30]研究一種含有G3-PAMAM-NH2和甲基丙烯酸二甲氨基異丙酯的新型防齲粘接劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其具有較強(qiáng)的抗菌性能和誘導(dǎo)牙本質(zhì)仿生礦化的能力，意味著可以實(shí)現(xiàn)脫礦抑制和再礦化促進(jìn)的雙重效果。

Xiao等[31]研制了一種包含NACP、甲基丙烯酸甲酯（dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMADHM）、 2-甲基酰氧乙基磷酰膽堿（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC）和納米銀（silver nanoparticles，NAg）的生物活性多功能復(fù)合材料（簡稱BMC），其中DMADHM、MPC、NAg的添加顯著增強(qiáng)了材料的蛋白排斥及抗菌性能，將其與G3-PAMAM-NH2聯(lián)合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了人牙根部牙本質(zhì)在循環(huán)人工唾液/乳酸環(huán)境中最大程度的牙本質(zhì)仿生礦化，且使其在21 d后恢復(fù)到與健康根部牙本質(zhì)相當(dāng)?shù)挠捕?，提示BMC+PAMAM復(fù)合材料可作為治療根面齲Ⅴ類洞的修復(fù)手段。值得注意的是，牙本質(zhì)表面快速的礦物沉積可能會導(dǎo)致一種超礦化現(xiàn)象，從而阻止礦物向牙本質(zhì)管深層繼續(xù)沉積。

Vasile等[32]用琥珀酸端基的PAMAM制備了尺寸、大小穩(wěn)定的金-樹枝狀納米復(fù)合材料，在模擬體液1.5倍加速礦化模型中驗(yàn)證了該材料同樣具有誘導(dǎo)HAP形成的潛力。

盡管以上研究證明了PAMAM與其他無機(jī)材料結(jié)合引導(dǎo)再礦化的策略有良好的應(yīng)用前景，然而水溶液中游離的樹狀大分子并不能促進(jìn)晶體生長，為了實(shí)現(xiàn)牙體硬組織原位仿生礦化，必須提高PAMAM與牙硬組織基質(zhì)（主要是HAP）之間的結(jié)合能力，且該能力可能會對控制晶體形態(tài)、尺寸產(chǎn)生積極影響[19]。Chen等[33]使用第7代PAMAM-COOH來探測納米棒狀的釉質(zhì)的表面電荷陣列，用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）表征了枝狀體在晶體表面的分布情況，發(fā)現(xiàn)其沿c-軸方向且有規(guī)律的間隔（相距約45 nm）。采用蒙特卡羅方法模擬樹枝狀大分子與晶體表面的結(jié)合過程，計(jì)算樹狀大分子的-COOH基團(tuán)與釉質(zhì)晶體表面的結(jié)合強(qiáng)度，結(jié)果表明，釉質(zhì)表面和生物蛋白質(zhì)的電荷在二者結(jié)合中起重要作用。同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，氨基端的PAMAM比羧酸端的PAMAM與晶體表面結(jié)合能力更強(qiáng)。天然磷灰石的等電點(diǎn)為pH5.6[34]，因此研究假定釉質(zhì)晶體在pH7.4環(huán)境中帶負(fù)電荷，解釋了帶正電荷的PAMAMNH2結(jié)合能力明顯強(qiáng)于PAMAM-COOH的原因，然而不能排除電荷分布圖案受到釉質(zhì)晶體表面有機(jī)材料的某種影響，故仍需進(jìn)一步研究。Wu等[35]合成了一種HAP錨定的胺丁羥磷酸鹽（alendronate，ALN）與PAMAM-COOH分子的復(fù)合物ALN-PAMAM-COOH，由于HAP與ALN的良好結(jié)合力，ALN-PAMAM-COOH能夠在人工唾液環(huán)境中對脫礦釉質(zhì)表面進(jìn)行原位仿生礦化，且大分子難以被磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗脫。不同于目前大多數(shù)牙體硬組織仿生礦化實(shí)驗(yàn)在人工唾液/模擬體液培養(yǎng)條件下進(jìn)行，Xie等[36]通過將大鼠脫礦牙本質(zhì)樣本縫合到大鼠雙頰的方法，研究G3.5-PAMAM-COOH在大鼠唾液環(huán)境中誘導(dǎo)大鼠牙齒礦化的能力，結(jié)果表明G3.5-PAMAM-COOH能促進(jìn)牙本質(zhì)仿生礦化，且對牙本質(zhì)小管有較明顯阻塞效果。

3 PAMAM的生物安全性研究

近年來牙體硬組織仿生礦化領(lǐng)域的研究表明：PAMAM無論是在礦化調(diào)控還是誘導(dǎo)晶體成核方面都具有一定的作用，這些作用與PAMAM的代數(shù)及表面基團(tuán)等相關(guān)。但是，PAMAM的毒性也引起了關(guān)注。PAMAM作為納米藥物向環(huán)境中釋放，其濃度可能不斷增加，因此不可忽視對其生物學(xué)特性的研究。Oliveira等[37]用斑馬魚胚胎作為脊椎動(dòng)物模型來評估PAMAM的毒性，結(jié)果表明G3、G4-PAMAMNH2在斑馬魚胚胎中有部分免疫反應(yīng)，可能與其毒性有關(guān)，G3、G4-PAMAM的半數(shù)致死濃度分別為1.8和2.3 mg·L-1。學(xué)者[38]提出PAMAM的毒性可能與表面官能團(tuán)逐代呈指數(shù)增長以及-NH2的濃度有關(guān)，為了避免PAMAM與細(xì)胞的直接接觸，可以通過化學(xué)蓋層的方法介導(dǎo)-NH2的細(xì)胞毒性作用（PAMAM的游離-NH2基團(tuán)與乙酰氯發(fā)生反應(yīng)，生成中性樹狀大分子），胺封蓋處理后的pamamm-g-diazirine粘接劑在小鼠體內(nèi)毒性降低了一個(gè)數(shù)量級。此外，也有學(xué)者[39]提出樹狀大分子表面-NH2基團(tuán)的正電荷與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層帶負(fù)電荷組分間產(chǎn)生的靜電作用是影響樹狀大分子細(xì)胞毒性的重要因素，通過胺封蓋處理可以有效減少PAMAM-NH2與脂質(zhì)雙層間的反應(yīng)，從而提升PAMAM作為納米藥物的安全性。

盡管PAMAM及相關(guān)復(fù)合材料在牙體組織上進(jìn)行仿生礦化的能力已被證實(shí)，然而有關(guān)PAMAM聚合物代數(shù)、表面基團(tuán)、濃度及處理時(shí)間等因素的具體影響機(jī)制尚未有公認(rèn)明確的解釋；再礦化層的物理和化學(xué)特性（顯微硬度、抗酸、抗力特性等）方面的研究也僅處于初期探索階段；PAMAM誘導(dǎo)仿生礦化的實(shí)驗(yàn)大多是在開放環(huán)境中進(jìn)行的，其在樹脂牙本質(zhì)粘接界面微環(huán)境內(nèi)是否具有相同的誘導(dǎo)脫礦牙本質(zhì)仿生礦化的作用等，以上這些關(guān)鍵性問題的解決有賴于實(shí)驗(yàn)手段的不斷提高和更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累。PAMAM在牙科領(lǐng)域展現(xiàn)出發(fā)展前景的同時(shí)，也需要進(jìn)行藥理學(xué)和毒理學(xué)篩選，只有通過不斷的研究才能正確評價(jià)PAMAM作為納米藥物的安全性，這一點(diǎn)對于臨床安全用藥具有重要意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。