郭婷婷，萬楚筠，黃鳳洪

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，武漢 430062； 2.油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；3.農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062)

菜籽餅為油菜籽低溫壓榨后獲得的加工副產(chǎn)物，2018年我國菜籽餅供給量達(dá)1 000萬t。研究發(fā)現(xiàn)，菜籽餅中除了含12%～15%殘油[1]外，還含有微量的營養(yǎng)成分，如Canolol、生育酚、植物甾醇等。Canolol由芥子酸脫羧而成，占總游離酚酸的70%～85%[2]，是油菜籽中主要的多酚類化合物之一，具有良好的抗氧化、抗誘變性能[3]。生育酚是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑，能有效抑制脂質(zhì)氧化。油菜籽中的生育酚主要為α-生育酚和γ-生育酚，且γ-生育酚的含量相對較高[4]。植物甾醇具有降低膽固醇、預(yù)防動脈粥樣硬化和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等生理功能。谷甾醇是油菜籽中主要的植物甾醇，其次是菜油甾醇和菜籽甾醇[5]。

亞臨界流體萃取技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型提取分離技術(shù)，其在常溫或者較低溫度下即可進(jìn)行，很大程度上保護(hù)了易揮發(fā)性和熱敏性成分不被破壞[6]。目前，亞臨界流體萃取技術(shù)已被用于多酚[7]、黃酮[8]、蝦青素[9]等天然活性成分的萃取及多環(huán)芳烴[10]等風(fēng)險因子的監(jiān)測。本文以亞臨界1，1，1，2-四氟乙烷(r134a)-丁烷混合溶劑為萃取劑，考察r134a與丁烷配比對亞臨界萃取菜籽餅中Canolol、生育酚和植物甾醇的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，以期為提高菜籽餅利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菜籽餅，由中雙11號雙低油菜籽低溫壓榨所得，水分和殘油分別為4.80%和12.79%；5α-膽甾醇、正己烷、甲醇、乙醇、氫氧化鉀、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS)、正丁烷(純度99.90%)、1,1,1,2-四氟乙烷(r134a，純度99.5%)，均為分析純；正己烷、異丙醇、乙酸、甲醇，均為色譜純。

亞臨界流體萃取裝置，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所定制；Avanti J-26離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；GX-25型多功能粉碎機(jī)；BS-11水浴搖床，韓國JeioTech公司；Agilent 6890N氣相色譜；Acquity超高效液相色譜，美國Waters公司；LC-6AD液相色譜，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界r134a-丁烷萃取菜籽餅中脂質(zhì)微量成分

將菜籽餅粉粹，過40～60目篩。稱取300 g菜籽餅粉于萃取袋中，系口后置于亞臨界流體萃取裝置的萃取罐中，加蓋密封；開啟真空泵使萃取罐、分離罐和計量罐中壓力降至-0.01 MPa。按照料液比1∶8加入r134a-丁烷混合溶劑，對物料進(jìn)行靜態(tài)萃取。萃取結(jié)束后，打開萃取罐與分離罐連接閥門，將萃取液導(dǎo)入分離罐。開啟壓縮機(jī)進(jìn)行減壓和溶劑回收，當(dāng)萃取罐中壓力降至0.15 MPa以下時，同時開真空泵，直至三罐壓力降為-0.01 MPa脫溶結(jié)束。破真空，分別從分離罐和萃取罐中收集萃取油和粕。萃取油于8 000 r/min離心10 min，取上層油4℃保存待檢測。

1.2.2 微量成分的測定

1.2.2.1 Canolol測定

參照Yang等[11]方法并做部分修改。稱取1.25 g待測樣(精確到0.000 1 g)，加入1.5 mL正己烷和1.5 mL 80%甲醇溶液。在振動混合器上萃取5 min，然后于5 000 r/min離心10 min。保留下層液，上清液重復(fù)萃取3次，合并3次萃取液混勻。用0.22 μm濾膜過濾，濾液用于UPLC分析。UPLC分析條件：Waters Acquity BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相A為2%乙酸水溶液，流動相B為100%甲醇，梯度洗脫程序?yàn)?%～25% B(7.40 min)、25%～29% B(2.67 min)、29%～36% B(6.66 min)、36%～45% B(6.67 min)、45%～65% B(2 min)、65%～5%B(10 min)、5% B(4.6 min)；流速0.21 mL/min；柱溫30℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量3 μL。

1.2.2.2 生育酚測定

參照AOCS Official Method Ce 8-89并做部分修改。稱取約2 g待測樣(精確到0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，旋渦混勻，過0.22 μm濾膜，濾液用于HPLC分析。HPLC分析條件：色譜柱為硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為正相，正己烷-異丙醇(體積比99.5∶0.5)；流速1 mL/min；檢測波長292 nm(α-生育酚)和298 nm(γ-生育酚)；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2.3 植物甾醇測定

參照Xie等[12]方法并做部分修改。稱取樣品200 mg(精確到0.000 1 g)于50 mL離心管內(nèi)，加入0.5 mL 5α-膽甾醇溶液(0.5 mg/mL)，室溫下超聲5 min。加入10 mL 2 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，60℃水浴搖床反應(yīng)60 min。取出后置于振動混合器上振搖2 min，冷卻后加入4 mL水和5 mL正己烷，萃取2 min，于5 000 r/min離心3 min，收集上層液。向下層液中加5 mL正己烷，萃取3 min，于5 000 r/min離心5 min。合并2次上層液，加入1.5 g無水硫酸鈉脫水，取5 mL提取液于10 mL樣品瓶中，在80℃烘箱中蒸發(fā)溶液。加入100 μL BSTFA+TMCS，于105℃反應(yīng)15 min。取出冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷進(jìn)行GC分析。GC分析條件：DB-5HT 色譜柱(30 m×0.22 mm×0.1 μm)；進(jìn)樣口、檢測器溫度320℃；載氣為氦氣，流速2 mL/min；分流比25∶1；程序升溫條件為60℃保持1 min，以40℃/min升至310℃，保持10 min；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.3 微量成分萃取量的計算

萃取量=c×m1/m2

式中：c為微量成分在萃取油中的含量，mg/100 g；m1為萃取油質(zhì)量，g；m2為菜籽餅質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 r134a與丁烷質(zhì)量比對萃取菜籽餅脂質(zhì)微量成分的影響

在亞臨界混合溶劑萃取過程中，固定萃取溫度為35℃，萃取時間為30 min，研究r134a與丁烷質(zhì)量比對萃取油中微量成分Canolol、植物甾醇、生育酚萃取量的影響，結(jié)果如圖1～圖3所示。

由圖1可見，隨著混合溶劑中r134a比例的降低，Canolol萃取量呈先增大后減少的趨勢，當(dāng)r134a與丁烷質(zhì)量比為6∶3時，Canolol萃取量達(dá)到最大值，為1.77 mg/100 g。由圖2可見，r134a與丁烷質(zhì)量比對菜籽餅中α-生育酚、γ-生育酚和總生育酚萃取量的影響具有相似的趨勢，具體表現(xiàn)為當(dāng)r134a與丁烷質(zhì)量比由6∶1增加到6∶3時，α-生育酚、γ-生育酚和總生育酚萃取量迅速上升，之后趨于平緩。由圖3可見，菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇及總甾醇萃取量隨著混合溶劑中r134a比例的降低而逐漸增大，且增長率逐漸減小。

圖1 r134a與丁烷質(zhì)量比對Canolol萃取量的影響

圖2 r134a與丁烷質(zhì)量比對生育酚萃取量的影響

圖3 r134a與丁烷質(zhì)量比對植物甾醇萃取量的影響

不同r134a與丁烷質(zhì)量比對亞臨界流體萃取菜籽餅中微量成分的不同影響主要是由混合溶劑對各微量成分的溶解性差異造成的。Hildebrand等[13]提出溶解度參數(shù)可用來表征物質(zhì)之間相互溶解性，其定義為液體內(nèi)聚能密度的平方根。在此基礎(chǔ)上，Hansen[14]建立了三維溶解度參數(shù)體系，即漢森溶解度參數(shù)(HSP)。物質(zhì)間相互作用力主要有原子色散力、分子偶極力和電子交換氫鍵力。HSP表征物質(zhì)分子極性的相對大小，分子極性(Xp)可表示為HSP中分子偶極力分量(permanent dipole forces，δp)和電子交換氫鍵力分量(hydrogen bonding，δh)平方和與總?cè)芙舛葏?shù)(δt)平方之商[15]。萬楚筠[16]進(jìn)一步計算并確定了r134a、丁烷Xp值分別為0.7和0，CanololXp值為0.5，而生育酚、植物甾醇Xp值約為0.2和0.15。5種物質(zhì)中r134a分子極性最強(qiáng)，而丁烷分子極性最弱?；旌先軇┲衦134a所占比例極高或極低都會阻礙各微量成分的溶出，只有當(dāng)二者以適當(dāng)比例混合才有助于提高微量成分的萃取量。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在實(shí)際應(yīng)用中，通常設(shè)定萃取溫度為25～45℃，萃取時間為10～50 min。采用L9(34)正交表，以r134a與丁烷質(zhì)量比、萃取時間、萃取溫度為自變量，以Canolol、總生育酚、總植物甾醇萃取量為評價指標(biāo)，對亞臨界混合溶劑萃取菜籽餅中脂質(zhì)微量成分工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

由表2、表3可見，r134a與丁烷質(zhì)量比、萃取時間、萃取溫度對亞臨界萃取菜籽餅中脂質(zhì)微量成分Canolol、生育酚和植物甾醇均有極顯著性影響(P<0.000 1)。以Canolol、總生育酚和總植物甾醇萃取量為評價指標(biāo)，各因素的影響順序均為r134a與丁烷質(zhì)量比>萃取溫度>萃取時間，最佳工藝條件均為A2C3B2，即r134a與丁烷質(zhì)量比6∶3、萃取溫度45℃、萃取時間30 min。在最佳工藝條件下，Canolol、總生育酚和總植物甾醇萃取量分別為2.43、9.71、89.17 mg/100 g。

3 結(jié) 論

采用亞臨界r134a-丁烷混合溶劑萃取菜籽餅中微量成分Canolol、生育酚和植物甾醇，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)萃取條件為：r134a與丁烷質(zhì)量比6∶3，萃取溫度45℃，萃取時間30 min。在最優(yōu)萃取條件下，Canolol萃取量為2.43 mg/100 g，總生育酚萃取量為9.71 mg/100 g，總植物甾醇萃取量為89.17 mg/100 g。