蔡鑫 唐芳 馬武開 周靜 蘭維婭 李宇 蔣總 樊梅

(1貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

骨組織生命活動(dòng)周期包括骨吸收和骨形成，這一過(guò)程被稱為骨重塑，其中間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為成骨細(xì)胞起主導(dǎo)作用〔1，2〕，對(duì)維持人體骨量和體液中鈣離子濃度十分重要。在骨重塑中，骨吸收與骨形成的協(xié)調(diào)失衡會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)減少甚至骨質(zhì)疏松，許多與骨代謝異常相關(guān)的疾病如骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生與骨質(zhì)流失密切相關(guān)。Wnt/β-catenin通路是骨骼發(fā)育和骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)通路〔3～6〕，能調(diào)節(jié)Wnt途徑相關(guān)因子的表達(dá)，激活細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化或使正常骨細(xì)胞代謝受抑制。其調(diào)控骨細(xì)胞生命過(guò)程具有雙面性，例如Wnt聯(lián)合受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5功能缺失使骨量下降，其激活突變則引起高骨量的發(fā)生；細(xì)胞厚體(DKK)1的高表達(dá)抑制骨形成，使用DKK1拮抗劑后可促進(jìn)成骨分化。研究中醫(yī)藥調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨代謝相關(guān)機(jī)制已逐漸成為熱點(diǎn)，已有較多學(xué)者取得了一定成果，這對(duì)于發(fā)揮中醫(yī)藥潛在治療優(yōu)勢(shì)具有重要意義〔7～10〕。

1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的Wnt蛋白家族成員至少有19種，大多數(shù)在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)相應(yīng)的特定作用，只有少部分具有相同功能。但是從生化層面來(lái)看，不同的Wnts對(duì)其表面受體卷曲蛋白(Fzd)的影響卻很相似，均與Fzd在富含半胱氨酸的N端相互作用而發(fā)揮生物效應(yīng)〔11〕。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活基于Wnt蛋白和其受體的結(jié)合，進(jìn)一步?jīng)Q定了下游基因的表達(dá)〔12〕。在正常穩(wěn)態(tài)下，被磷酸化的β-catenin與軸蛋白(Axin)、結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因編碼的蛋白(APC)和糖原合成酶激酶(GSK)-3β組成降解復(fù)合物，在該復(fù)合物中β-catenin被泛素化標(biāo)記并進(jìn)一步降解，細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平較低〔13〕。Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，分泌出的Wnt蛋白通過(guò)結(jié)合跨膜受體Fzd和LRP5/6啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)LRP5/6的尾部磷酸化，將Axin招募至細(xì)胞膜下并與磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，Axin移除后，β-catenin在降解復(fù)合物中被蓬亂蛋白(Dsh)釋放出來(lái)，因此β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集，最終轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(TCF/LEF)結(jié)合而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄〔14，15〕。Wnt信號(hào)通路的拮抗劑如骨硬化蛋白(SOST)、Dickkopfs(DKK1/2/3)和分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP)1通過(guò)直接與Wnt蛋白結(jié)合或干擾Wnt蛋白與其受體間的相互作用而阻止β-catenin向核內(nèi)移位〔16〕。

影響Wnt/β-catenin途徑的因素眾多，包括LRP5/6、多種由Wnt基因編碼的激活蛋白及一些抑制劑如SOST、Dickkopfs、sFRP1等，但是這些因子的共同作用靶點(diǎn)都是β-catenin，將胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin降解失活或促使其轉(zhuǎn)移向核內(nèi)與靶基因相互作用，調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin通路。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨代謝

Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞骨形成活性和破骨細(xì)胞骨吸收功能而調(diào)控骨代謝，對(duì)維持正常骨量至關(guān)重要，已有研究證實(shí)該通路是刺激成骨細(xì)胞增殖、分化活性的關(guān)鍵信號(hào)通路〔17～20〕。大量細(xì)胞和調(diào)節(jié)因子〔21〕參與維持骨重塑平衡，包括破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和MSCs；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、Osterix轉(zhuǎn)錄因子、堿性磷酸酶(ALP)、一型膠原蛋白(COL1A1)等。在這些類型的細(xì)胞中，由多核細(xì)胞和MSCs分化而來(lái)的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分別負(fù)責(zé)骨吸收和骨形成〔22～24〕。

2.1骨形成 激活經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化和礦化，抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)骨形成〔25～27〕。以β-catenin為代表的正向調(diào)控蛋白能激活下游TCF/LEF等因子促進(jìn)骨細(xì)胞增殖〔28〕。有研究顯示W(wǎng)nt蛋白通過(guò)與LRP5/6和Fz綁定，抑制GSK-3β活性而促進(jìn)胞質(zhì)β-catenin的穩(wěn)定〔29〕。成骨細(xì)胞的分化可促進(jìn)Runx2、Osterix、COL1A1等的表達(dá)和分泌〔30，31〕。Runx2在成骨細(xì)胞分化中直接與成骨細(xì)胞關(guān)鍵性特異基因的啟動(dòng)區(qū)域相互作用促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)育〔32〕。COL1A1是由成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生的糖蛋白，為骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，共同在骨重塑中發(fā)揮重要作用〔33〕。Runx2和Osterix調(diào)控著多種成骨細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)，如ALP和COL1A1〔34〕。胡中青等〔35〕證實(shí)通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能上調(diào)RunxZ和Osterix表達(dá)，有效促進(jìn)骨髓MSCs(BMSCs)向成骨分化發(fā)育、改善骨缺損。

2.2骨破壞 Glass等〔36〕在對(duì)老鼠基因的研究中首次報(bào)道了Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于破骨細(xì)胞的重要性，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)會(huì)影響MSCs向成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨形成能力減弱，骨密度下降〔37，38〕。LRP5是骨重塑關(guān)鍵調(diào)控因子，此基因缺失會(huì)使成骨增殖分化功能下降〔39〕。小鼠骨組織內(nèi)DKK1呈高水平表達(dá)時(shí)，成骨分化明顯受到抑制〔40〕。Osterix特定表達(dá)在發(fā)育骨骼中，當(dāng)其被選擇性敲除后會(huì)導(dǎo)致小鼠骨形成障礙，對(duì)調(diào)控骨形成和骨吸收有重要意義〔41，42〕。Sclerostin是一種由SOST基因編碼，經(jīng)骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生糖蛋白，通過(guò)與成骨細(xì)胞上LRP5/6的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin通路，從而負(fù)向調(diào)控骨形成〔43〕，而使用SOST拮抗劑可增加骨形成和減少骨吸收，使骨質(zhì)量、骨密度迅速增加〔44〕，并且這一結(jié)果已在臨床人體試驗(yàn)中得到肯定〔45，46〕。此外，多種其他類型Wnt信號(hào)通路拮抗劑在骨骼代謝中抑制成骨分化的作用也在小鼠模型中被證實(shí)〔47〕。

3 中醫(yī)藥調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨代謝

中醫(yī)藥通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控骨代謝的機(jī)制較為復(fù)雜，對(duì)該通路中相關(guān)調(diào)控因子產(chǎn)生復(fù)合影響而非只對(duì)單一蛋白起作用。當(dāng)前的研究主要是單味中藥有效提取物和中藥復(fù)方制劑，所影響的調(diào)節(jié)因子廣泛，包括正向調(diào)控因子Wnts、LRP5、Runx2和負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白DKK1、SOST、GSK-3β等。

3.1中醫(yī)藥干預(yù)正向調(diào)控因子

3.1.1Wnt蛋白與骨代謝 BMSCs通過(guò)自身較強(qiáng)的自我更新和多向分化能力而維持機(jī)體骨量，具有低免疫原性和易獲取等特點(diǎn)〔48，49〕。復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊能有效提高骨組織中Wnt3a表達(dá)，經(jīng)干預(yù)后的BMSCs中促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2和β-catenin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明該方通過(guò)調(diào)控MEKK2-Wnt耦聯(lián)抑制β-catenin被降解而促進(jìn)成骨分化〔50〕。章建華等〔51，52〕以骨質(zhì)疏松(OP)腎陰虛和腎陽(yáng)虛兩種證型為研究點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)左歸丸和右歸丸含藥血清均能上調(diào)大鼠成骨細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)，提升ALP的活性，對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有積極作用。但是左歸丸對(duì)于腎陰虛證型OP成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用更明顯，而腎陽(yáng)虛證型OP中右歸丸的效果更強(qiáng)，與“左歸丸補(bǔ)腎陰，右歸丸補(bǔ)腎陽(yáng)”的經(jīng)典中醫(yī)理論相符。氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡使骨量下降而引發(fā)OP，叉頭框O蛋白家族(FoxO)在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)oxO和β-catenin結(jié)合后，β-catenin與TCF的轉(zhuǎn)錄作用被競(jìng)爭(zhēng)性抑制而減少成骨細(xì)胞形成〔53，54〕。激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能抑制上述反應(yīng)過(guò)程〔55，56〕，成鵬等〔57〕構(gòu)建去卵巢大鼠OP模型，觀察到經(jīng)黃芪甲苷干預(yù)后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)得Wnt2a和β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，F(xiàn)oxO蛋白家族成員FoxO3a表達(dá)受到抑制，能有效調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞代謝、改善大鼠骨量減少所致的OP。

3.1.2LRP5與骨代謝 陳云剛等〔58〕使用骨碎補(bǔ)含藥血清干預(yù)大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)LRP5、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)及提升ALP的活性，促進(jìn)BMSCs向成骨分化。DKK1的高表達(dá)會(huì)抑制成骨細(xì)胞代謝，何幫劍等〔59〕發(fā)現(xiàn)益骨湯含藥血清能有效提高大鼠骨組織LRP5基因表達(dá)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，這可能與抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中DKK1的表達(dá)有關(guān)。彭昕等〔60〕采取由補(bǔ)骨脂丸為原方而研制出的壯骨止痛膠囊〔61〕干預(yù)體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的方法，觀察到藥物組LRP5和β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高，可能具有與雌激素相似的治療絕經(jīng)后OP的作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)益骨湯含藥血清也能通過(guò)上調(diào)骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路LRP5、β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖〔59〕。

3.1.3Runx2與骨代謝 史巖等〔62〕用RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)骨碎補(bǔ)黃銅干預(yù)后的體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，結(jié)果顯示Runx2、β-catenin mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，表明該方通過(guò)上調(diào)Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵活化因子表達(dá)來(lái)促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。在另一項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)通過(guò)提高Runx2的表達(dá)有利于成骨分化〔58〕。黃精多糖可激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路而促進(jìn)MSCs成骨分化〔63〕，彭小明等〔64〕進(jìn)一步證實(shí)黃精多糖能明顯提升成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2、ALP活性，激活β-catenin易位到細(xì)胞核與成骨靶基因Runx2結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。益骨湯具有上調(diào)大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路成骨分化核心蛋白R(shí)unx2表達(dá)而調(diào)控成骨增殖過(guò)程的作用〔65〕。銀杏葉提取物通過(guò)刺激Runx2基因表達(dá)和提高ALP活性對(duì)細(xì)胞成骨分化起積極作用，COL1A1、β-catenin等蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)〔66〕。

3.2中醫(yī)藥干預(yù)負(fù)向調(diào)控因子

3.2.1DKK1與骨代謝 成骨細(xì)胞增殖分化活性能被破骨細(xì)胞間接抑制而使骨量減少〔67〕，清熱活血方可以顯著下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型滑膜與血清中DKK1 mRNA和蛋白表達(dá)，通過(guò)Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的分化平衡來(lái)抑制骨破壞〔68〕。楊文雪等〔69〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎舒脊顆粒通過(guò)上調(diào)DKK1和SOST而抑制強(qiáng)直性脊柱炎患者受累關(guān)節(jié)骨化過(guò)程，同時(shí)抑制Wnt5a和β-catenin mRNA表達(dá)，影響Wnt通路對(duì)骨細(xì)胞的調(diào)控，這與鄢澤然等〔70〕的研究結(jié)果一致。使用菟絲子黃酮混懸液灌胃去卵巢大鼠一方面抑制了DKK1的表達(dá)、增強(qiáng)成骨分化，另一方面能提升血液中β-catenin水平、抑制破骨細(xì)胞成熟〔71〕。張志達(dá)等〔72〕研究左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素性O(shè)P大鼠骨量的影響，結(jié)果顯示左歸丸能較好改善骨質(zhì)量，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)DKK1 mRNA表達(dá)、增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性而發(fā)揮抗OP作用。

3.2.2SOST與骨代謝 補(bǔ)腎健脾活血方不僅能提高被沉默SOST腺病毒載體傳染的成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性，上調(diào)骨保護(hù)素和骨橋蛋白表達(dá)，而且當(dāng)過(guò)表達(dá)SOST感染后也能取得類似的干預(yù)效果，表明該方可能是通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路中SOST的表達(dá)來(lái)發(fā)揮骨重建作用〔73，74〕。柴生颋等〔75〕通過(guò)建立sFRP1高表達(dá)及沉默組基因載體并聯(lián)合補(bǔ)腎方藥含藥血清干預(yù)大鼠骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎方藥在一定程度上抑制sFRP1的表達(dá)，提高細(xì)胞中β-catenin蛋白水平而調(diào)控骨代謝。

3.2.3GSK-3β、Axin與骨代謝 有學(xué)者使用刺老苞根皮含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞后，經(jīng)Western印跡和熒光定量PCR法測(cè)得Axin mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，有效提高了β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)，成骨分化與增殖功能得到加強(qiáng)，其機(jī)制可能與由Axin、β-catenin、APC、GSK-3β等組成的降解復(fù)合物被破壞相關(guān)〔76〕。張哲等〔77〕采取老鸛草素干預(yù)小鼠BMSCs的方法研究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物作用后GSK-3β mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)激活Wnt3a蛋白的表達(dá)，而DKK1可以抑制該過(guò)程，說(shuō)明老鸛草素是通過(guò)激活Wnt3a/β-catenin通路發(fā)揮誘導(dǎo)BMSCs增殖和向成骨方向分化的作用；而涂艷等〔78〕則發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能上調(diào)GSK-3β mRNA表達(dá)，提升β-catenin和Wnt10a等蛋白水平來(lái)調(diào)控BMSCs向成骨分化。此外也有研究顯示淫羊藿苷能抑制破骨細(xì)胞活性，用于治療骨量下降誘發(fā)的OP有較好效果〔79，80〕。

綜上所述，基于中醫(yī)藥調(diào)控Wnt/β-catenin影響骨代謝的機(jī)制十分復(fù)雜，既可通過(guò)上調(diào)正向調(diào)控因子mRNA和蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，維持正常的骨量；也能拮抗該通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子的表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞活性，使骨形成和骨吸收這一骨重塑過(guò)程穩(wěn)定在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。目前采用針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的生物制劑進(jìn)行治療骨代謝病已表現(xiàn)出較好的早期效果，并可能在不久的將來(lái)進(jìn)入臨床領(lǐng)域，如抗DKK1蛋白抗體等治療藥物的研發(fā)不僅可以促進(jìn)骨形成，還有望逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等造成的骨質(zhì)流失。中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)的Wnt/β-catenin骨代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子較多，如果能對(duì)其干預(yù)機(jī)制有更深層次、更詳盡的認(rèn)識(shí)，這相對(duì)于干預(yù)單一靶基因可能效果更佳。因此，中醫(yī)藥治療骨代謝性疾病具有極大的潛力，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步增強(qiáng)研究力度，充分研發(fā)并使之臨床應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)。