羅斯譯 柴利 阮思蓓 凌鳳 李昕 高子清 李麗 楊志惠 唐明希西南醫(yī)科大學(xué)（四川瀘州644000）；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科（四川瀘州644000）；廣東省婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所（廣州50000）

乳腺癌為全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，已成為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［1-2］。本文通過(guò)國(guó)內(nèi)最新指南《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2019版）》再評(píng)價(jià)IHC和FISH檢測(cè)結(jié)果的一致性，并評(píng)估新版指南人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）基因狀態(tài)和蛋白表達(dá)及與各臨床病理特征關(guān)系，為乳腺癌患者正確選擇治療方案和預(yù)后評(píng)估提供重要參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料選取2010年11月-2019年6月經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科確診為浸潤(rùn)性乳腺癌并進(jìn)行FISH和IHC檢測(cè)的女性乳腺癌患者1 182例。組織標(biāo)本主要來(lái)源于瀘州、宜賓、內(nèi)江、自貢等川南地區(qū)。標(biāo)本類型為乳腺癌根治手術(shù)切除標(biāo)本1 067例和粗針穿刺標(biāo)本115例。年齡17～90歲，平均（45.07±9.54）歲。選取的所有病例均有完整FISH報(bào)告記錄和ER、PR、HER-2/neu等IHC切片以及年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理資料。根據(jù)《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2019版）》和《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2014版）》指南中IHC和FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行再判讀和差異統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)ISH再判讀主要通過(guò)查閱檢測(cè)報(bào)告記錄，IHC再判讀由2名副教授復(fù)閱切片完成。

1.2 試劑與探針I(yè)HC中ER、PR和Her-2/neu檢測(cè)使用羅氏公司抗體（ER克隆號(hào)：SP1；PR克隆號(hào)：1E2；Her-2/neu克隆號(hào)：4B5）；Ki-67抗體（克隆號(hào)：MIB.I）由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。FISH檢測(cè)采用北京金普嘉公司HER-2基因擴(kuò)增試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC法新鮮標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋并連續(xù)切片3 μm，IHC操作按照En-Vision兩步法操作說(shuō)明進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕色或棕褐色為ER、PR、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞膜呈棕色為HER-2/neu陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 FISH法按照北京金普嘉公司HER-2基因擴(kuò)增試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行FISH檢測(cè)，具體的操作步驟如前述［3-4］。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 FISH結(jié)果判讀按照《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2019版）》［5］FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行再評(píng)價(jià)，雙探針FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)分以下5種情況：（1）第1組，HER2/CEP17比值≥ 2.0，且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0；此種情況判為FISH陽(yáng)性；此外，若HER2信號(hào)連接成簇時(shí)可直接判斷為FISH陽(yáng)性。（2）第2組，HER2/CEP17比值≥ 2.0，平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞＜4.0（此種情況需增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，若結(jié)果不變，則FISH判讀為陰性）。（3）第3組，HER2/CEP17比值＜ 2.0，平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥ 6.0（此種情況需增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，若結(jié)果不變，則判讀為FISH陽(yáng)性）。（4）第4組，HER2/CEP17比值＜ 2.0，平均HER2拷貝/細(xì)胞數(shù)≥4.0且＜6.0（此種情況需增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，若結(jié)果不變，需對(duì)兩次結(jié)果進(jìn)行綜合判斷分析。若仍為上述情況，此類患者需要結(jié)合IHC結(jié)果，若IHC結(jié)果為3+，HER2狀態(tài)則為陽(yáng)性。若IHC結(jié)果為0、1+或2+，HER2狀態(tài)應(yīng)判讀為陰性）。（5）第5組，HER2/CEP17比值＜ 2.0，HER2拷貝/細(xì)胞數(shù)＜4.0，此種情況判讀為FISH陰性。

1.4.2 IHC結(jié)果判斷HER-2/neu蛋白表達(dá)強(qiáng)度判讀參照《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2019版）》［5］進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0軟件，采用Kappa檢驗(yàn)對(duì)IHC和FISH檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，HER2基因狀態(tài)及蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1 182例乳腺癌HER2/neu蛋白表達(dá)和HER-2基因擴(kuò)增情況IHC法檢測(cè)1 182例乳腺癌患者組織標(biāo)本，HER-2蛋白表達(dá)（-）者22例（1.86%），（+）者146例（12.35%），（2+）者889例（75.21%），（3+）者125例（10.58%），HER-2/neu蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1。FISH檢測(cè)HER-2基因擴(kuò)增312例（26.40%），無(wú)擴(kuò)增870例（73.60%），F(xiàn)ISH檢測(cè)情況見(jiàn)圖2。

圖1 HER-2/neu蛋白表達(dá)評(píng)分結(jié)果圖Fig.1 IHC scored of Her-2/neu protein expression

圖2 FISH結(jié)果（CEP 17呈綠色，HER-2呈紅色，F(xiàn)ISH油鏡×100）Fig.2 FISH results（CEP17 stained green and HER-2 gene stained red，F(xiàn)ISH oil mirror× 100）

2.2 FISH檢測(cè)乳腺癌組織HER2/neu蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增結(jié)果比較在新標(biāo)準(zhǔn)下：IHC和FISH檢測(cè)陰性符合率為100%；HER-2蛋白表達(dá)（+）與FISH檢測(cè)陰性符合率為93.84%；HER-2蛋白表達(dá)（2+）與FISH檢測(cè)陽(yáng)性符合率為25.42%；HER-2蛋白表達(dá)（3+）與FISH檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為61.60%。IHC和FISH檢測(cè)結(jié)果總體一致率為40.06%，存在一致性（Kappa=0.089，P=0.000）且呈正相關(guān)（r=0.194，P=0.000），見(jiàn)表1。

表1 FISH及IHC檢測(cè)HER-2基因狀態(tài)和蛋白表達(dá)新舊指南一致率比較Tab.1 Comparison the coincidence rate of new and old standards for detection of HER-2 gene status and protein expression by FISH and IHC

2.3 1 182例乳腺癌HER-2基因擴(kuò)增及HER2/neu蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性ER、PR、ER/PR表達(dá)狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與HER2基因擴(kuò)增（χ2=169.047，P=0.000；χ2=73.931，P=0.000；χ2=79.883，P=0.000；χ2=7.752，P=0.021）及HER-2/neu蛋白表達(dá)（χ2=47.667，P=0.000；χ2=61.055，P=0.000；χ2=13.646，P＜ 0.05；χ2=11.472，P＜0.05）差異具有顯著性（組間比較用卡方檢驗(yàn)）；組織學(xué)分級(jí)與HER-2/neu蛋白表達(dá)正相關(guān)，而與HER2基因擴(kuò)增無(wú)明顯相關(guān)性。ER表達(dá)與HER2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.360，P＜0.001；r=-0.078，P＜ 0.05），PR、ER/PR狀態(tài)與HER2基因擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)（r=-0.248，P＜ 0.001；r=-0.256，P＜0.001），與HER-2/neu蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)（P＞0.05）。此外，HER-2基因擴(kuò)增與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量呈正相關(guān)。HER-2/neu蛋白表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)正相關(guān)，年齡與HER-2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

3 討論

HER-2基因是一種具有酪氨酸激酶活性的185 kD跨膜糖蛋白受體，可與HER家族成員形成二聚體而使細(xì)胞內(nèi)激酶活化而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖［6］，研究發(fā)現(xiàn)，約20%乳腺癌患者有HER-2的過(guò)表達(dá)，而HER-2過(guò)表達(dá)患者預(yù)后較差、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、生存期較短且對(duì)內(nèi)分泌治療和標(biāo)準(zhǔn)化療治療的效果均不佳［7］。但隨著HER-2陽(yáng)性乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗及其聯(lián)合藥物的應(yīng)用極大地改善了HER-2陽(yáng)性患者的預(yù)后［8］。因此，能否正確檢測(cè)和評(píng)估HER-2狀態(tài)對(duì)乳腺癌治療方案選擇和預(yù)后評(píng)估極其重要，特別是抗HER-2陽(yáng)性靶向治療個(gè)體化方案的制定和療效評(píng)估。

本研究結(jié)果顯示，新指南下本地區(qū)HER-2總體蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為10.58%，低于楊雅潔（26.35%）［9］及周國(guó)江（21.25%）［10］等的報(bào)道，可能與本研究IHC（-/+）以及IHC（3+）樣本量較少而以IHC（2+）為主有關(guān)。新指南下本地區(qū)HER-2基因陽(yáng)性表達(dá)率26.40%，與國(guó)外報(bào)道的15%～30%［11］基本相符，略高于國(guó)內(nèi)張虹等［12］報(bào)道的23.05%，但低于要建超（38%）［13］、國(guó)風(fēng)（41.9%）［14］及周國(guó)江等報(bào)道的43.75%［10］，一方面反映出與新指南結(jié)合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷貝數(shù)及IHC對(duì)HER-2狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)估和取消“可疑”判讀標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，同時(shí)，也不排除不同地區(qū)［15］及種族［16-17］間HER-2陽(yáng)性表達(dá)率可能存在的差異。

新指南下FISH陰性和IHC（-）的符合率為100%，與本文舊標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，也與其他報(bào)道相符［13-14］；FISH陰性和IHC（+）的符合率為93.84%，與舊標(biāo)準(zhǔn)本地區(qū)的92.46%和有研究［18］報(bào)道的100%，與要建超等［13］報(bào)道的93.30%基本一致，提示IHC（-/+）者與FISH結(jié)果高度一致；新標(biāo)準(zhǔn)下的FISH陽(yáng)性和IHC（2+）符合率為25.42%，與GHEYBI等報(bào)道的 27.50%［19］及國(guó)風(fēng)等報(bào)道的 28.63%［14］一致。本研究與LATEEF等［20］研究結(jié)果相同均認(rèn)為對(duì)于IHC（2+）者需常規(guī)行FISH檢測(cè)進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)估HER-2狀態(tài)；新標(biāo)準(zhǔn)下FISH陽(yáng)性和IHC（3+）符合率為61.60%，與筆者舊標(biāo)準(zhǔn)的57.6%和筆者已經(jīng)報(bào)道的 54.67%［4］、60.98%［21］及其周國(guó)江等報(bào)道的 58.82%［10］基本一致，但低于要建超等［13］報(bào)道的78.9%，這可能與本研究IHC（3+）樣本量較少，且多為5年以前樣本而與當(dāng)時(shí)樣本固定、IHC檢測(cè)抗原修復(fù)法等因素有關(guān)。盡管在新舊指南中均認(rèn)為IHC（3+）患者明確判讀為陽(yáng)性，但鑒于本研究中IHC（3+）和FISH陽(yáng)性符合率較低（61.60%），且研究［22］認(rèn)為FISH相對(duì)于IHC而言能更好識(shí)別HER-2/neu陽(yáng)性病例，故IHC（3+）者也建議進(jìn)一步做FISH檢測(cè)以明確HER-2狀態(tài)。因此，筆者認(rèn)為IHC（2+/3+）者都應(yīng)進(jìn)一步行FISH檢測(cè)，以完善診斷并指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。新指南考慮IHC對(duì)HER-2的影響，并取消了HER-2“可疑狀態(tài)”的判讀標(biāo)準(zhǔn)，使臨床對(duì)乳腺癌患者靶向藥物應(yīng)用更加明確和完善。

表2 Her-2/neu蛋白表達(dá)、HER-2基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性Tab.2 Association of HER-2/neu protein expression，HER-2 gene status and clinical-pathological characteristics 例

本研究中ER表達(dá)與HER-2基因擴(kuò)增和HER-2/neu蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)，PR表達(dá)及ER/PR狀態(tài)與HER2基因擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)，以上相關(guān)性均與周國(guó)江等［10］和何春燕等［23］的報(bào)道一致，提示ER、PR表達(dá)陰性者其腫瘤預(yù)后較差可能與HER-2基因高表達(dá)及擴(kuò)增率有關(guān)。此外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與HER-2基因擴(kuò)增呈正相關(guān)，與要建超等［13］的報(bào)道一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)與HER-2/neu蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與筆者的報(bào)道［4，21］、SHI等［24］及要建超等［13］的報(bào)道一致，可能與HER2基因擴(kuò)增后腫瘤細(xì)胞增殖使瘤體增大、組織學(xué)分級(jí)增高有關(guān)。

綜上，新舊指南下IHC（-/+）與FISH結(jié)果均高度一致，F(xiàn)ISH仍是評(píng)價(jià)IHC（2+/3+）者HER-2基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。新指南結(jié)合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷貝數(shù)、IHC對(duì)HER-2狀態(tài)的影響，并取消了HER-2“可疑狀態(tài)”的判讀標(biāo)準(zhǔn)，提高了FISH檢測(cè)的陰性率，使臨床對(duì)患者的靶向用藥及預(yù)后評(píng)估更為準(zhǔn)確。由于本研究的具體例數(shù)有限，也不排除不同地域、不同年齡及不同種族對(duì)結(jié)果的影響，相關(guān)數(shù)據(jù)還需大量、長(zhǎng)期、多中心的調(diào)查及臨床療效的評(píng)估，使患者對(duì)靶向藥物的應(yīng)用及預(yù)后評(píng)估更加有效和準(zhǔn)確。