榮欣欣 黃紅梅 李靜佳 侯令密 劉家有 李金穗 謝少利 楊懿 鄧世山川北醫(yī)學(xué)院解剖教研室（四川南充637000）；川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科（四川南充637000）

乳腺癌是女性最常見的癌癥和死亡的主要原因。其中，中國乳腺癌死亡病例占全球的1/10，嚴(yán)重影響女性健康［1-2］。因而，尋找乳腺癌治療的靶點(diǎn)或者新的思路成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)。人體蛋白質(zhì)的降解途徑主要有兩種：溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑（UPP）。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶（E1）、泛素連接酶（E2s）、泛素-蛋白連接酶（E3s）、26s蛋白酶體和去泛素化酶（DUBs）等組成。泛素蛋白連接酶E3A（ubiquitin protein ligase E3A，UBE3A）是泛素-蛋白連接酶（E3s）中的一員，主要作用是泛素化連接相關(guān)的靶蛋白，使其通過UPP途徑被降解。泛素特異性蛋白酶25（ubiquitin specific protease 25，USP25）是一種去泛素化酶，能夠去泛素化相關(guān)的底物蛋白，從而避免底物蛋白被UPP途徑降解。UBE3A與USP25均為泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的組成成員，其中UBE3A與天使綜合征的關(guān)系密切［3-6］，而在乳腺癌中的研究較少；USP25在炎癥免疫反應(yīng)中研究較多［7-9］，而在乳腺癌中的作用尚未見報(bào)道。DENG等［10］通過限制性片段差異顯示多聚酶鏈反應(yīng)（RFDD-PCR）對(duì)泛素蛋白酶體組成部分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，UBE3A與USP25在乳腺癌組織中均高表達(dá)（＞3倍），但未對(duì)其在乳腺癌中的作用和它們之間的關(guān)系作具體研究。本課題通過免疫組化染色觀察UBE3A與USP25在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并分析它們與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為乳腺癌的臨床研究及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象所有乳腺組織標(biāo)本來自川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2017-2018年手術(shù)切除的組織，包括癌組織與鄰近相對(duì)正常的組織，病理診斷均為浸潤性導(dǎo)管癌，并收集了相關(guān)的臨床、病理資料，共50例。患者年齡36～70歲，其中＜60歲41例，≥60歲9例。癌組織病理分化程度分級(jí)：WHOⅠ級(jí)13例，WHOⅡ級(jí)25例，WHOⅢ級(jí)12例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購至中國科學(xué)院細(xì)胞總庫，shRNA-UBE3A慢病毒委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司合成。兔抗人USP25多克隆抗體（Abcam，美國），兔抗人UBE3A多克隆抗體（Abcam，美國），山羊抗兔IgG二抗（Proteintech，中國），UBE3A、USP25上下游引物（生工生物工程股份有限公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光超特敏試劑盒（碧云天，中國），SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化及結(jié)果判斷免疫組化采用En-Vision法染色：65℃烤箱內(nèi)烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟10 min，梯度酒精水化各3 min，流水沖洗5 min，枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)煮沸15 min，冷卻后PBS液洗3次×3 min，3%H2O2去離子水常溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS液洗3次×3 min，10%的羊血清37℃、封閉非特異性抗原10 min，滴加一抗4℃冰箱過夜，37℃恒溫箱復(fù)溫20 min，PBS液洗3次×3 min，滴加二抗37℃恒溫箱中孵育40 min，PBS液洗3次×3 min，按說明書配制DAB顯色液，DAB顯色，流水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染3 min，流水沖洗5 min，1%鹽酸酒精分色10 s，流水沖洗5 min，梯度酒精脫水各3 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min，中性快干膠封片，普通顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。PBS代替一抗作空白對(duì)照，癌旁組織染色作陰性對(duì)照。光鏡下觀察，UBE3A與USP25主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用半定量計(jì)分法進(jìn)行分析［11］。陽性細(xì)胞率：≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度：無顯色為0分，淺黃色為1分，中等棕黃色為2分，深棕黃色為3分。兩項(xiàng)指標(biāo)得分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：0～4分為陰性（-），5～12分為陽性（+）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。慢病毒轉(zhuǎn)染按照吉?jiǎng)P基因說明書進(jìn)行。

1.2.3 qRT-PCR按照試劑盒說明書提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在LightCycler PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件：（1）預(yù)變性：95 ℃、30 s，1 cycle；（2）2步法PCR反應(yīng)：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 cycle；（3）溶解：95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，95 ℃、1 s，1 cycle；（4）降溫：50 ℃、30 s，1 cycle。

1.2.4 Western Blot檢測配置RIPA∶PMSF=100∶1的裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，抗原抗體免疫反應(yīng)，ECL超特敏化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，熒光成像儀內(nèi)曝光條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用方差分析，其中兩兩比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中UBE3A與USP25的表達(dá)UBE3A與USP25主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖1）。50例乳腺癌組織，UBE3A在32例中表達(dá)陽性，陽性率64%（32/50），而在鄰近相對(duì)正常組織中為陰性表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.059，P＜ 0.001）；USP25在36例乳腺癌組織中表達(dá)陽性，陽性率72%（36/50），而在鄰近相對(duì)正常組織中為陰性表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=56.250，P＜ 0.001）。

圖1 UBE3A與USP25在乳腺癌及癌旁相對(duì)正常組織中的表達(dá)情況（EnVision法，200×）Fig.1 Expression of UBE3A and USP25 in breast cancer and adjacent normal tissues（EnVision method，200 ×）

2.2 UBE3A、USP25在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系將UBE3A、USP25的表達(dá)情況與患者臨床病理特征間的關(guān)系進(jìn)行分析（表1），在乳腺癌組織中，UBE3A與USP25的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.001，P=0.041），其陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；UBE3A與USP25的表達(dá)均與Ki-67的表達(dá)相關(guān)（P＜0.001，P=0.029），且在Ki-67高表達(dá)組（Ki-67≥14%）陽性表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ki-67低表達(dá)組（Ki-67＜14%）。另外，USP25在乳腺癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)（病理分化程度）相關(guān)（χ2=6.270，P=0.046），其陽性率隨著分化程度降低而逐漸升高。

2.3 UBE3A敲減結(jié)果驗(yàn)證在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中敲減UBE3A的表達(dá)，并檢測基因和蛋白的敲減水平（圖2、3）。在空白組、陰性對(duì)照組、敲減UBE3A組UBE3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1、1.000 ± 0.024、0.345 ± 0.012（F=1 761.405，P＜0.001），UBE3A蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.877±0.034 、0.793 ± 0.071、0.374 ± 0.031（F=90.231，P＜0.001）。UBE3A mRNA在敲減UBE3A組的表達(dá)量為空白組的34.5%，敲減率65.5%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；UBE3A蛋白在敲減UBE3A組的表達(dá)量為空白組的42.5%，敲減率為57.5%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；兩者在陰性對(duì)照組與空白組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.974，P=0.079），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UBE3A的基因與蛋白被有效敲減。

圖2 Western Blot檢測UBE3A的敲減水平Fig.2 Knockdown level of UBE3A detected by Western Blot

圖3 UBE3A mRNA及蛋白的敲減水平Fig.3 Knockdown levels of UBE3A mRNA and protein

表1 UBE3A、USP25的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between UBE3A，USP25 and clinicopathological features of breast cancer

2.4 敲減UBE3A后觀察USP25 mRNA的表達(dá)水平在空白組、陰性對(duì)照組、敲減UBE3A組USP25 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1、1.033±0.055、0.400± 0.023（F=318.953，P＜ 0.001）。敲減UBE3A組的USP25 mRNA表達(dá)量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），陰性對(duì)照組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.288），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲減UBE3A后USP25mRNA表達(dá)明顯降低（圖4）。

2.5 敲減UBE3A后觀察USP25蛋白的表達(dá)水平在空白組、陰性對(duì)照組、敲減UBE3A組USP25蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.551±0.030、0.539±0.014、0.207 ± 0.010（F=293.410，P＜ 0.001）。敲減UBE3A組USP25蛋白的表達(dá)量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），陰性對(duì)照組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.472），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲減UBE3A后USP25蛋白表達(dá)明顯降低（圖5、6）。

圖4 Q-PCR檢測敲減UBE3A后USP25mRNA的表達(dá)水平Fig.4 Expressionof USP25mRNA after UBE3A knockdown detected by Q-PCR

圖5 Western Blot檢測敲減UBE3A后USP25蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression of USP25 protein after UBE3A knockdown detected by Western Blot

圖6 Western Blot檢測敲減UBE3A后USP25蛋白的表達(dá)水平Fig.6 Expression of USP25 protein after UBE3A knockdown detected by Western Blot

3 討論

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到UBE3A在乳腺癌組織中高表達(dá)，并且與Ki-67的表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。UBE3A的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)相關(guān)（P＜0.001），在Ki-67高表達(dá)組（Ki-67≥14%）陽性表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ki-67低表達(dá)組（Ki-67＜14%），Ki-67是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，表達(dá)越高腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，這可能提示UBE3A與乳腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)；UBE3A的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.001），其陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，可能提示UBE3A與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中敲減UBE3A基因可使annexinA2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，UBE3A基因可能通過調(diào)節(jié)annexinA2的表達(dá)而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等［12］。在肝細(xì)胞癌中UBE3A介導(dǎo)sirt6降解，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且在肝細(xì)胞癌的小鼠模型中證實(shí)，sirt6的下調(diào)和隨后誘導(dǎo)的annexinA2是UBE3A介導(dǎo)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵［13］。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中USP25在乳腺癌組織中高表達(dá)，且和組織學(xué)分級(jí)（病理分化程度）、Ki-67的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。USP25在乳腺癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)（病理分化程度）相關(guān)（P=0.046），其陽性率隨著分化程度降低而逐漸升高，在高分化腫瘤中的陽性率低于低分化腫瘤，這可能與乳腺癌從高分化到低分化的惡性進(jìn)展密切相關(guān)；USP25的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)相關(guān)（P=0.029），且在Ki-67高表達(dá)組（Ki-67≥14%）陽性表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ki-67低表達(dá)組（Ki-67＜14%），Ki-67是細(xì)胞增殖標(biāo)志物，此結(jié)果可能提示USP25的表達(dá)和乳腺癌增殖有密切關(guān)系；USP25的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.041），其陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，可能表明USP25的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。USP25在乳腺癌中的作用尚未見報(bào)道，但在非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC）中，USP25高表達(dá)，并且USP25的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、Ki-67的表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-200c能夠抑制USP25的表達(dá)從而抑制非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移［14］。USPs家族中其他成員在乳腺癌中也有類似的報(bào)道：USP14在乳腺癌組織中表達(dá)增高，且與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、Ki-67和淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中觀察到USP14促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展［15］；USP21在三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于其他亞型乳腺癌，在TNBC細(xì)胞中敲除USP21后抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，研究證實(shí)USP21在乳腺癌中的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的成瘤能力，并與NOD樣受體信號(hào)通路有關(guān)［16］。USP22在乳腺癌組織中高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67等呈正相關(guān)，多元Cox回歸分析顯示USP22表達(dá)水平是總體存活率或無病生存率的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素［17］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UBE3A與USP25在乳腺癌組織中均高表達(dá)，且在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中敲減UBE3A后USP25基因及蛋白的表達(dá)量明顯降低（P＜0.001），這可能提示UBE3A與USP25在乳腺癌泛素蛋白酶體系統(tǒng)中功能作用更加活躍且保持動(dòng)態(tài)平衡，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。DENG等［10］使用RFDD-PCR及2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)組成部分進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白酶體亞單位基因（PSMB5、PSMD1、PSMD2、PSMD8與PSMD11）、4個(gè)泛素特異性蛋白酶基因（USP9X、USP9Y、USP10與USP25）及1個(gè)泛素蛋白連接酶E3A基因（UBE3A）在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)（＞3倍），其結(jié)果提示乳腺癌中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)泛素化及去泛素化活動(dòng)均明顯加強(qiáng)，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可能與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)多環(huán)節(jié)、多步聚功能改變有關(guān)。

綜上，UBE3A與USP25在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)，在乳腺癌泛素蛋白酶體系統(tǒng)中UBE3A與USP25功能作用明顯增強(qiáng)且保持動(dòng)態(tài)平衡，它們可能共同作用促進(jìn)乳腺癌的的發(fā)生發(fā)展。因而，在乳腺癌的治療中，可能通過降低UBE3A或USP25的表達(dá)，或者通過抑制UBE3A調(diào)控USP25的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。目前，關(guān)于泛素蛋白酶體系統(tǒng)及組成成員抑制劑的研究報(bào)道較多，部分已經(jīng)用于臨床［18-22］。針對(duì)UBE3A或USP25表達(dá)陽性的乳腺癌患者，使用特異性的抑制劑減少乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移成為可能。然而，此次研究樣本量還不足夠大，后期還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；另外，UBE3A與USP25在乳腺癌中的作用機(jī)制還不十分清楚，以及UBE3A如何調(diào)控USP25的表達(dá)等都還需進(jìn)一步研究。